瘧疾是由惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1（PfEMP1）介導(dǎo)的被感染紅細胞在微血管中的積聚所驅(qū)動。PfEMP1通過其富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域間α1區(qū)（CIDRα1）與人內(nèi)皮蛋白C受體（EPCR）結(jié)合，進而導(dǎo)致惡性瘧疾發(fā)病。然而，該結(jié)構(gòu)域存在非常多的變體，給相關(guān)抗瘧療法的開發(fā)帶來挑戰(zhàn)。因此，長期以來有一個懸而未解的問題，即由個體產(chǎn)生的抗體能否識別大量帶有不同CIDRα1結(jié)構(gòu)域的PfEMP1變體。

在本文中，研究團隊從瘧疾高發(fā)地區(qū)人血中分離并表征了兩種針對CIDRα1的廣譜作用單抗，它們可以識別六個CIDRα1亞類中的五個，并能抑制CIDRα1與EPCR的結(jié)合。在模擬生理血流狀態(tài)的三維人腦微血管模型中，兩種抗體均能抑制受感染紅細胞在人內(nèi)皮細胞表面粘附。結(jié)構(gòu)研究顯示，這兩種抗體有著相似的作用機制，它們通過與CIDRα1中與EPCR結(jié)合的三個高度保守氨基酸殘基的相互作用，從而抑制CIDRα1與EPCR的結(jié)合。這些廣譜作用的抗體可能代表了針對嚴(yán)重瘧疾的獲得性免疫的一種通用機制，同時也為相關(guān)疫苗或治療方案設(shè)計提供了新的思路。

從人血中發(fā)現(xiàn)并表征CIDRα1廣譜型抗體

烏干達的托羅羅鎮(zhèn)是瘧疾傳播強度極高的地區(qū)，據(jù)估算，該地區(qū)每人每年會遭受125次感染性叮咬。因此，本研究采集了該地區(qū)3名成人的血樣，以兩個差異巨大的CIDRα1變體作為抗原進行單B細胞篩選和測序，同時對抗體與34種CIDRα1變體的結(jié)合活性進行評估（圖1 a b）。其中C7、C62、C74抗體對大部分CIDRα1亞類（5/6）具有廣譜的結(jié)合能力和EPCR結(jié)合抑制作用（圖1 c）。通過對序列的分析發(fā)現(xiàn)，C7和C62屬于同一克隆譜系，且?guī)缀跬耆嗤识鴮7和C74進行后續(xù)研究。以IgG₁形式重組表達的C7和C74保留了對不同CIDRα1的結(jié)合能力，和EPCR的結(jié)合抑制作用（圖1 d）。生物膜干涉結(jié)果表明，C7和C74以高親和力與多種CIDRα1變體結(jié)合（圖1 f）。研究團隊使用了于2007年采集的中低瘧疾傳播水平地區(qū)的93名個體的血樣，發(fā)現(xiàn)C7 Fab可以通過競爭結(jié)合來抑制這些血樣中IgG對不同CIDRα1的結(jié)合作用（圖1 e）。這些結(jié)果表明，大部分能夠識別CIDRα1的IgG表位與C7重疊。

圖1 發(fā)現(xiàn)靶向PfEMP1 CIDRα1結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體

C7和C74抑制受瘧原蟲感染的紅細胞在人內(nèi)皮細胞表面粘附

接下來研究團隊對C7和C74能否與受瘧原蟲感染紅細胞表面的PfEMP1結(jié)合進行了評估。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，C7和C74可以結(jié)合表達PfEMP1 CIDRα1.4、CIDRα1.6，而非CIDRα1.1的受感染紅細胞，這與上述抗體親和力評估的結(jié)果相吻合（圖2 a）。進一步，研究團隊采用體外三維人腦微血管模型，模擬在腦動靜血管中的流速和應(yīng)力，發(fā)現(xiàn)這兩種抗體可以抑制受感染紅細胞在人內(nèi)皮細胞表面的粘附（圖2 b）。

圖 2 C7和C74對受惡性瘧原蟲感染的紅細胞的結(jié)合及細胞粘附抑制作用

C7靶向CIDRα1與EPCR的結(jié)合位點

首先，研究團隊解析了C7 Fab與CIDRα1.4的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)C7 Fab能夠直接結(jié)合到CIDRα1.4的EPCR結(jié)合（EB）螺旋以及EPCR結(jié)合輔助（EBS）螺旋這兩個EPCR結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域上，直接阻斷CIDRα1.4與EPCR的結(jié)合（圖3 a-c）。

進一步，為了探究C7廣譜作用的分子機制，研究團隊解析了C7與PfEMP1蛋白N末端結(jié)構(gòu)域（NTS–DBLα–CIDRα1.7–DBLβ）的結(jié)合機制（圖3 d）。雖然DBLα和DBLβ由于高度靈活無法解析，但解析了C7與CIDRα1.7的結(jié)合界面（圖3 e）。將C7 Fab-CIDRα1.4和C7 Fab-CIDRα1.7的結(jié)構(gòu)疊加發(fā)現(xiàn)，C7的表位幾乎一致（圖3 f）。

具體而言，C7的主要結(jié)合作用機制如下：1.CIDRα1與EPCR的結(jié)合中心有一個保守的雙苯丙氨酸基序（FF），能夠形成一個疏水區(qū)域，使第二個F能夠伸入EPCR的疏水口袋，進而形成穩(wěn)定的復(fù)合物。C7 H-CDR3形成了一個疏水凹槽，含有三個芳香族氨基酸，使得FF可以伸入并形成π 堆積相互作用，從而模擬EPCR與CIDRα1的結(jié)合。2.除了FF基序外，C7的結(jié)合還依賴于CIDRα1 EBS N末端保守的谷氨酸位點與H-CDR3的酪氨酸和絲氨酸的相互作用（圖3 g）。類似地，研究團隊對C74的結(jié)合機制進行了解析，發(fā)現(xiàn)C7與C74具有相似的作用模式。

圖 3 C7 Fab與PfEMP1 N末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合機制

CIDRα1被C7和C4識別的關(guān)鍵表位是保守的

CIDRα1中C7和C74的結(jié)合位點在很大程度上重疊，在EB和EBS上共有十個公共位點，它們大多暴露在未結(jié)合的PfEMP1復(fù)合物表面，其中4個是保守的，包括前面提到的FF和E。當(dāng)把CIDRα1.4、CIDRα1.5或CIDRα1.8中的FFE任一位點替換為丙氨酸時，會導(dǎo)致C7和C74的親合力下降。CIDRα1.1在EB上有一個LF/Y基序，且在EBS N末端的賴氨酸與CIDRα1.4–1.8相比發(fā)生了1個氨基酸的位移。將這些位點突變，形成FF基序和處于正確位置的賴氨酸，使得C7和C74獲得了對CIDRα1.1的結(jié)合能力。這些結(jié)果表明這三個關(guān)鍵氨基酸位點對CIDRα1的廣譜識別能力的重要性（圖4 a-c）。

圖 4 C7和C74識別CIDRα1表位的保守性和表面暴露情況

C7對CIDRα1的廣譜性依賴于體細胞超突變（SHM）

C7和C74在H-CDR3長度、SHM、輕鏈配對方面存在差異，但均使用重鏈V基因V_H3–48，因此研究人員推測，這個V基因是否足以支撐抗體對不同CIDRα1的廣譜作用。通過分別將C7重鏈、輕重鏈除CDR3以外部分的突變回復(fù)成胚系，發(fā)現(xiàn)兩種抗體對CIDRα1的廣譜作用消失了（圖5 a-b）。分子動力學(xué)模擬研究表明，C7的H-CDR3呈現(xiàn)單一主要構(gòu)象，而將突變回復(fù)成胚系后，H-CDR3表現(xiàn)出高構(gòu)象多樣性，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（圖5 c）。并且，將H–CDR1回復(fù)為胚系后，C7的廣譜作用消失，而回復(fù)H–CDR2無此影響（圖5 d）。這表明成熟的H–CDR1在C7廣譜作用方面的重要性，同時也說明SHM對獲得針對CIDRα1的廣譜型抗體至關(guān)重要。

圖 5 C7單克隆抗體的胚系基因分析

關(guān)注點

1.        本研究從瘧疾高度傳播地區(qū)人群的血液中發(fā)現(xiàn)了對不同CIDRα1變體具有廣譜結(jié)合作用的抗體C7和C74，并解析了它們相似的作用機制。這一發(fā)現(xiàn)極大地推進了瘧疾的發(fā)病機制研究，同時也為抗瘧疾疫苗和藥物的研發(fā)帶來了新的契機。

2.        本文中使用的抗體篩選和表征策略，也可應(yīng)用于其他靶蛋白高度多變的疾病研究，通過篩選廣譜性抗體并解析其作用機制，可能找到高變靶蛋白的關(guān)鍵保守表位，用于相關(guān)療法和藥物的研發(fā)。

3.        Rapid Novor（快序生物）是全球唯一能實現(xiàn)血清多抗直接測序的公司。利用該技術(shù)，可以快速從人血清多抗中獲得優(yōu)質(zhì)抗體，助力抗體藥物研發(fā)。例如對于本研究，可以通過抗原富集對CIDRα1具有廣譜結(jié)合能力的抗體，直接測序獲得單抗序列。

4.        文中使用了2007年采集的血樣，從中富集到了能結(jié)合CIDRα1的IgG。這一結(jié)果表明即使長期保存，血樣中的多抗依然可以保持生物學(xué)功能，可用于抗體測序。因此血清多抗測序技術(shù)也非常適合用于這類珍貴樣本的分析。

參考文獻

[1] Reyes RA, Raghavan SSR, Hurlburt NK, Introini V, Bol S, Kana IH, Jensen RW, Martinez-Scholze E, Gestal-Mato M, López-Gutiérrez B, Sanz S, Bancells C, Fernández-Quintero ML, Loeffler JR, Ferguson JA, Lee WH, Martin GM, Theander TG, Lusingu JPA, Minja DTR, Ssewanyana I, Feeney ME, Greenhouse B, Ward AB, Bernabeu M, Pancera M, Turner L, Bunnik EM, Lavstsen T. Broadly inhibitory antibodies to severe malaria virulence proteins. Nature. 2024 Dec;636(8041):182-189. doi: 10.1038/s41586-024-08220-3.