腫瘤新抗原作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)極具研究價(jià)值，然而它們?cè)谀[瘤細(xì)胞表面的表達(dá)量可能極低，使得靶向新抗原的T細(xì)胞療法開發(fā)面臨挑戰(zhàn)。在本文中研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)靶向由人類白細(xì)胞抗原（HLA）I類分子呈遞的p53R175H新抗原時(shí)，嵌合抗原受體（CAR）的敏感性比T細(xì)胞受體（TCR）低10-100倍。因此，研究團(tuán)隊(duì)通過“合成TCR和抗原受體（STAR）”來增強(qiáng)CAR的功能，開發(fā)了靶向常見p53R175H腫瘤新抗原的T細(xì)胞療法。STAR表現(xiàn)出了與TCR相當(dāng)?shù)男驴乖舾行裕以隗w內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，均可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面低密度的p53R175H發(fā)揮抗腫瘤活性[1]。
結(jié)果
CAR對(duì)HLA I呈遞p53R175H新抗原的敏感性遠(yuǎn)低于TCR
首先，研究團(tuán)隊(duì)基于靶向p53R175H的類TCR抗體（TCRm）和已報(bào)道的典型TCR構(gòu)建了CAR-T和TCR-T，比較了它們對(duì)于HLA-A*02:01 (HLA-A2)呈遞的p53R175H的敏感性（圖1 A）。結(jié)果表明，除CD4? TCR-1 T細(xì)胞外，其他構(gòu)建的T細(xì)胞都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的目的抗原結(jié)合能力（圖1 B）。進(jìn)一步的功能研究中發(fā)現(xiàn)，CAR-T在細(xì)胞毒性、激活T細(xì)胞、促干擾素- γ（IFN-γ）釋放方面的抗原敏感性弱于TCR-T 10-100倍，TCR-T在低密度新抗原條件下仍能發(fā)揮抗腫瘤作用（圖1 C-H）。
圖1 CAR和TCR針對(duì)相同p53R175H/HLA-A2敏感性的對(duì)比分析
STAR-T復(fù)現(xiàn)TCR-T的高抗原敏感性
基于TCR和抗體的合成類受體主要分為三類：嵌合抗原受體（CAR）、T細(xì)胞受體融合構(gòu)建體（TRuC）、合成T細(xì)胞受體和抗原受體（STAR）/HLA非依賴的T細(xì)胞受體（HIT）（圖2 A）。它們都是將抗體對(duì)抗原的高親和力特性與TCR的信號(hào)傳導(dǎo)能力相結(jié)合。接下來研究團(tuán)隊(duì)便比較了不同合成類受體對(duì)新抗原的敏感性差異。
在CD8? T細(xì)胞中，各受體均表現(xiàn)出了較好的結(jié)合抗原的能力（圖 2B）。當(dāng)改造的CD8? T細(xì)胞受到搭載不同劑量新抗原肽段的T2細(xì)胞系刺激時(shí)，只有STAR-T細(xì)胞對(duì)低密度新抗原刺激保持了與TCR-1類似的高細(xì)胞毒性（圖2 C）和促IFN-γ與腫瘤壞死因子α（TNF-α）釋放能力（圖2 D E）。STAR的抗原敏感性與TCR相似，比BBzCAR和28zCAR高出近100倍（圖2 F-H）。
圖 2. STAR 能重現(xiàn) TCR 的抗原敏感性
CD4? STAR-T可識(shí)別HLA I呈遞的p53R175H新抗原，且不依賴CD8
除CD8+外，CD4? T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中也發(fā)揮著重要作用。CD4? STAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出了對(duì)T2細(xì)胞最優(yōu)的細(xì)胞毒性、激活I(lǐng)FN-γ、TNF-α釋放（圖3 A-C）能力。綜上所述，STAR在CD4?和CD8+T細(xì)胞中均表現(xiàn)出了最強(qiáng)的新抗原敏感性。
CD8可以輔助TCR與抗原肽-MHC I復(fù)合物的結(jié)合，因此研究團(tuán)隊(duì)分別采用了兩種方法，探究CD8是否參與這些受體的作用：1.通過特異性抗體阻斷CD8（圖3 D E）；2. 敲除T2細(xì)胞的內(nèi)源性HLA-A2，并表達(dá)一種不與CD8結(jié)合，但保留與肽段和TCR相互作用的突變體HLA-A2（圖3 F G）。結(jié)果表明CD4+ STAR-T和CAR-T的作用不需要CD8的參與。
圖3 CD4? STAR-T和CAR–T對(duì)目的新抗原的識(shí)別不依賴CD8
進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和染色質(zhì)開放性測(cè)序（ATAC-Seq）分析了這些T細(xì)胞在抗原刺激后的轉(zhuǎn)錄水平以及染色質(zhì)可及性變化。主成分分析（PCA）結(jié)果表明，CD8+STAR-T與TCR-T細(xì)胞表現(xiàn)出了較高的相似性，其中第一主成分（PC1）的基因主要與T細(xì)胞激活相關(guān)（圖4 A-D）。CD4+STAR-T細(xì)胞也引起T細(xì)胞激活相關(guān)基因改變，但CD4+TCR-T細(xì)胞與未刺激T細(xì)胞相似。ATAC-Seq熱圖分析顯示，對(duì)于CD8+T細(xì)胞（圖4 E）和CD4+細(xì)胞（圖4 F），STAR引起效應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性增加。
圖4 CAR-T、TCR-T和STAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及染色質(zhì)可及性分析
STAR-T對(duì)低抗原密度細(xì)胞的體外抗腫瘤作用
研究團(tuán)隊(duì)分別在多種呈遞p53R175H新抗原的細(xì)胞上評(píng)價(jià)了STAR-T的抗腫瘤作用：1.轉(zhuǎn)入HLA-A2和p53R175H全長蛋白的K-562細(xì)胞；2.天然帶有p53R175H突變并轉(zhuǎn)入HLA-A2的SK-BR-3細(xì)胞（圖5 D F）；3.天然表達(dá)兩種分子的低抗原密度KLE（圖5 E G）和KMS-26（圖5 A-C）細(xì)胞。結(jié)果表明，STAR-T細(xì)胞對(duì)上述細(xì)胞均發(fā)揮最優(yōu)的抗腫瘤效果。
圖 5 STAR-T細(xì)胞的體外抗腫瘤效果
STAR-T對(duì)低抗原密度細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤作用
進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)價(jià)了這些改造的T細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤作用。結(jié)果表明，在低新抗原密度的SK-BR-3（圖6 A-C）和高新抗原密度的p53R175H/HLA-A2+ K-562（圖6 D-F）細(xì)胞構(gòu)建的小鼠腫瘤模型中，STAR-T細(xì)胞均表現(xiàn)出了最好的腫瘤作用。
圖6 STAR-T表現(xiàn)出對(duì)低抗原密度腫瘤良好的體內(nèi)治療效果
關(guān)注點(diǎn)：
1) 本研究采用的STAR策略能夠靶向腫瘤細(xì)胞表面低豐度的新抗原肽段，為腫瘤的免疫治療提供新的方案。
2) 鑒定新抗原在腫瘤細(xì)胞表面的真實(shí)呈遞依賴基于質(zhì)譜的方法，例如文中所用的KMS-26每細(xì)胞表面僅有1-2拷貝p53R175H新抗原，該數(shù)據(jù)便是通過質(zhì)譜分析所得[2]。
3) Rapid Novor(快序生物)基于質(zhì)譜和蛋白從頭測(cè)序技術(shù)的Immunovor腫瘤新抗原鑒定利器，可以一網(wǎng)打盡來自基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組層面所有突變的MHC I/MHCⅡ結(jié)合肽段，用于T細(xì)胞抗腫瘤療法的開發(fā)。
4) 本研究中利用已報(bào)道的TCRm抗體設(shè)計(jì)STAR，如果采用Rapid Novor（快序生物）的蛋白從頭測(cè)序技術(shù)，可以快速對(duì)單抗或血清多抗進(jìn)行測(cè)序，獲得優(yōu)質(zhì)抗體序列用于STAR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。
參考文獻(xiàn)：
[1] Huang D, et al. TCR-mimicking STAR conveys superior sensitivity over CAR in targeting tumors with low-density neoantigens. Cell Rep. 2024 Nov 26;43(11):114949. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114949.
[2] Hsiue EH, et al. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation. Science. 2021 Mar 5;371(6533):eabc8697. doi: 10.1126/science.abc8697.
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