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eBioMedicine|發(fā)現(xiàn)針對發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的廣譜強效中和抗體

2025-01-16

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)是一種新出現(xiàn)的蜱傳病毒,會引起嚴重的病毒性出血熱,死亡率高達12%-50%,然而目前缺乏有效的疫苗和干預措施?,F(xiàn)有的研究表明,SFTSV的N端糖蛋白(Gn)在識別宿主細胞受體過程中發(fā)揮關鍵作用。本研究分析了4名SFTSV感染康復者的Gn反應性記憶B細胞,采用單B細胞篩選技術,獲得出了18個對SFTSV有較好中和活性的抗體,并對其中高活性的三株抗體(JK-2, JK-8和JK-12)進行了結構和作用機制解析。在SFTSV毒株致死性感染小鼠模型中,JK-2和JK-8對5種SFTSV主要流行毒株的感染均有顯著的保護和治療效果[1]。


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結果

       從SFTSV感染康復捐獻者血液中發(fā)現(xiàn)結合Gn的單抗

首先,研究團隊篩選出了4名捐獻者,他們感染的是在中國主要流行的SFTSV基因型,且住院期間發(fā)生過持續(xù)性病毒血癥,未使用抗病毒藥物,經(jīng)檢測血液內(nèi)有高滴度中和抗體。對他們的外周血單個核細胞(PBMC)進行分析表明,一群B細胞(6.6%–17.2%)發(fā)生了IgG類別轉換(CD19+IgM-IgD-IgG+),其中一小部分(0.5%–1.9%)能識別結合Gn(圖1 A)。感染恢復后2個月采集的血液樣本中這些細胞的占比,高于1和6個月采集的樣本(圖1 B)。這些細胞中80%表達CD27,表明它們?yōu)橛洃汢細胞(圖1 C)。對這些細胞進行單B細胞基因克隆,共獲得并表達驗證了283個單抗,其中146種(51.6%)對Gn有結合活性(圖1 D)。與康復后1個月采血樣的1號捐獻者相比,2-4號捐獻者采樣間隔時間更長(2-6個月),他們篩選到的抗體體細胞超突變(SHM)頻率更高(圖1 E)。對配對的重鏈和輕鏈序列進行分析,發(fā)現(xiàn)4名捐獻者Gn反應性的B細胞存在克隆多樣性(圖1 F)。VDJ基因分析顯示,重鏈IGHV5-51/IGHV4-39/IGHV3-15/IGHV3-30和輕鏈IGKV1-5/IGLV1-40的使用和重排頻率較高(圖1 G H)。

圖1 Gn的抗體的克隆多樣性

       鑒定SFTSV的廣譜中和抗體

接下來,研究團隊分析了146種抗體對SFTSV I型病毒的中和作用,篩選出了18種抗體,它們在250 ng/mL濃度下表現(xiàn)出超60%的抑制效果(圖 2A)。這些抗體對5種SFTSV分支均表現(xiàn)出不同程度中和能力,其中JK-2、JK-8、JK-12、JK-77和JK-79對所有檢測的病毒均展現(xiàn)出強效、廣泛的保護作用(圖2 B C)。此外,這5種強效抗體均呈劑量依賴性抑制SFTSV在Vero細胞中的感染(圖2 D)。

圖2 篩選到的抗體對SFTSV有廣譜中和活性

        SFTSV抗體的抗原特異性及親和力測定

為了分析病毒表面與這18個抗體結合的主要表位,研究團隊利用生物膜干涉技術(BLI)開展了競爭結合分析,結果表明它們根據(jù)結合表位可分為6組(圖3 A)。其中JK-8親和力最高,平衡解離常數(shù)(KD)為1.0 pmol,其次為JK-2,KD為21.2 pmol(圖3 B)。

圖 3 Gn抗體的抗原特異性及親和力

       抗體對SFTSV的中和機制研究

通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測病毒粒子水平(圖4 A),發(fā)現(xiàn)使用JK-77、JK-2、JK-8 或 JK-3預孵育病毒可以有效抑制SFTSV感染THP-1細胞。流式細胞術結果表明,JK-2、JK-8以及JK-77能夠呈劑量依賴地抑制SFTSV與細胞結合(圖 4B)。當病毒以50 μg/mL的濃度分別與JK-2或JK-8預孵育時,SFTSV與細胞的結合分別顯著降低了約91%和88%(圖 4 C)。當把SFTSV與JK-2和JK-8孵育后,其感染細胞能力喪失,而JK-12或JK-65抗體沒有這種顯著的阻斷效果(圖4 D E)。

圖4 G JK-2和JK-8抑制SFTSV感染細胞

      Gn與中和抗體復合物的結構分析

為了更深入了解不同抗體具有獨特中和活性的分子機制,研究團隊選取了3種抗體(JK-2、JK-8和JK-12)與Gn頭部結構域形成復合物,進行冷凍電鏡結構分析。對抗體結合位點的整體比較結果表明(圖 5A),JK-2和JK-8結合到Gn的結構域I;JK-12結合到Gn的結構域III。JK-8與Gn之間的結合主要源于氫鍵和靜電力;JK-12與Gn之間的結合主要源于氫鍵、鹽橋、疏水作用。在模擬病毒粒子表面的SFTSV六聚體和五聚體中,JK-8能中高效結合Gn蛋白,不受相鄰區(qū)域的阻礙,而Gn的空間位阻影響JK-12結合(圖 5B)。這可能是JK-8和JK-2具有高親和力和良好中和效果,而JK-12雖有高親和力但缺乏阻斷活性的重要原因。

圖5 JK-2/JK-8/JK-12結合Gn的結構解析

      SFTSV抗體在致死性感染小鼠模型中的預防或治療效果

接下來,團隊構建了免疫缺陷的C57BL/6小鼠SFTSV致死性攻毒模型,評估了抗體對SFTSV導致小鼠死亡和體重降低的預防作用(圖7 A B)。JK-2和JK–8可以發(fā)揮完全的保護作用,在攻毒后3-5天可將血清病毒載量降低至檢測不到的水平(圖 7C)。進一步,研究團隊評估了JK-2和JK-8的治療效果。在攻毒后第1或2天給藥時,JK-2和JK-8都能對致死性SFTSV感染提供完全保護,這體現(xiàn)在存活率提高(圖 7D)、體重維持(圖 7E),以及對病毒血癥和病毒向脾臟、肺、肝、腎等組織擴散的抑制(圖 7F–H)。此外,給予JK-2或JK-8治療后,脾臟白髓萎縮等異常組織病理學變化均顯著減輕(圖 7I)。


圖6 SFTSV抗體在致死性感染小鼠模型中的保護作用

關注點:

1、本文中對SFTSV感染康復者的Gn反應性記憶B細胞進行單B細胞基因克隆,篩選得到了廣譜強效中和抗體,并解析了其與抗原的結合作用機制,這將推進SFTSV預防治療疫苗或藥物的研究。


2、文中選擇了四名高血清中和抗體滴度的捐獻者樣本進行測序。然而,抗體組庫包括BCR庫和分泌型抗體庫,僅對外周血中BCR測序無法反應分泌型抗體庫的真實組成和豐度,可能遺漏珍貴抗體。


3、Rapid Novor(快序生物)的REpAb是全球唯一的基于血清多抗直接測序的抗體發(fā)現(xiàn)技術,可以直接對抗原富集后,經(jīng)性能評估驗證的多抗蛋白進行測序,獲得輕重鏈正確配對,經(jīng)親和力驗證的抗體序列,復現(xiàn)原始多抗的優(yōu)異性能[2]。

 

參考文獻:

[1] Zhang S, Shang H, Han S, Li J, Peng X, Wu Y, Yang X, Leng Y, Wang F, Cui N, Xu L, Zhang H, Guo Y, Xu X, Zhang N, Liu W, Li H. Discovery and characterization of potent broadly neutralizing antibodies from human survivors of severe fever with thrombocytopenia syndrome. EBioMedicine. 2024 Dec 6;111:105481. doi: 10.1016/j.ebiom.2024.105481.

[2] Le Bihan T, Nunez de Villavicencio Diaz T, Reitzel C, Lange V, Park M, Beadle E, Wu L, Jovic M, Dubois RM, Couzens AL, Duan J, Han X, Liu Q, Ma B. De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination. Nat Commun. 2024 Oct 10;15(1):8790. doi: 10.1038/s41467-024-53105-8.