pTSC
pTSC復(fù)合體是由TSC1（Hamartin，130 kDa）、TSC2（Tuberin，200 kDa）和輔助蛋白TBC1D7（35 kDa，穩(wěn)定TSC1和TSC2之間的相互作用）組成的異源三聚體。這種大分子三聚體結(jié)構(gòu)使得pTSC復(fù)合體在體外純化時(shí)變得極為困難。目前，在樣品制備階段采用化學(xué)交聯(lián)或石墨烯氧化物涂層網(wǎng)格技術(shù)，已獲得近乎完整的冷凍電鏡密度圖，然而，這些方法可能無(wú)法反映pTSC的天然構(gòu)象狀態(tài)。

多倫多大學(xué)的Mazhab-Jafari實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了一種新策略，旨在研究pTSC復(fù)合體的天然構(gòu)型。他們利用“誘餌”抗體從動(dòng)物腦組織中捕獲內(nèi)源性pTSC。這種“誘餌”抗體是基于抗TSC2單抗設(shè)計(jì)的重組Fab片段。首先，團(tuán)隊(duì)使用Rapid Novor（快序生物）的REmAb單克隆抗體測(cè)序服務(wù)來(lái)測(cè)定抗TSC2抗體的可變區(qū)完整氨基酸序列，這些序列為合理設(shè)計(jì)和工程化重組表達(dá)抗TSC2抗體的輕重鏈提供了基礎(chǔ)。利用重組表達(dá)的Fab片段，研究人員直接從大鼠和豬的腦組織中純化出pTSC復(fù)合體。隨后，他們使用負(fù)染色電子顯微鏡（NSEM）對(duì)純化的pTSC樣品進(jìn)行了可視化，并進(jìn)一步通過(guò)免疫金電子顯微鏡（IGEM）技術(shù)，評(píng)估了TSC1和TSC2亞基的空間位置。有趣的是，在電鏡下觀察到了柔性絲狀物，這表明內(nèi)源性pTSC可能聚合成絲狀超結(jié)構(gòu)。

盡管重組蛋白的表達(dá)和純化是制備蛋白樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法，但對(duì)于一些“難以表達(dá)”的蛋白或蛋白復(fù)合體來(lái)說(shuō)，這是一個(gè)極為繁瑣的過(guò)程。此項(xiàng)研究開(kāi)辟了一條從天然來(lái)源分離蛋白的新途徑。通過(guò)單克隆抗體測(cè)序服務(wù)測(cè)出抗體的氨基酸序列，并將其工程化以精確捕獲那些難以表達(dá)的蛋白或蛋白復(fù)合體，例如pTSC。這種創(chuàng)新的純化策略，不僅提高了捕獲目標(biāo)蛋白的能力，而且極大地簡(jiǎn)化了蛋白結(jié)構(gòu)的表征過(guò)程。

利用抗TSC2抗體序列設(shè)計(jì)和重組表達(dá)Fab片段來(lái)純化pTSC

關(guān)鍵點(diǎn)：

• 使用Rapid Novor（快序生物）的單克隆抗體測(cè)序服務(wù)測(cè)出了抗TSC2抗體的可變區(qū)序列。根據(jù)序列信息重組表達(dá)Fab片段，以從天然哺乳動(dòng)物腦組織中純化pTSC。

• 新穎的重組蛋白表達(dá)與純化技術(shù)，為獲取多樣化的蛋白及蛋白復(fù)合體奠定了基礎(chǔ)，特別是對(duì)于傳統(tǒng)方法難以表達(dá)的蛋白。

  
  

  參考文獻(xiàn)：

  Dai, D.L., Hasan, S.M.N., Woollard, G., Abbas, Y.M., Bueler, S.A., Julien, J-P., Rubinstein, J.L., Mazhab-Jafari, T. Structural Characterization of Endogenous Tuberous Sclerosis Protein Complex Revealed Potential Polymeric Assembly.Biochemistry-us 60, 1808–1821 (2021).https://doi.org/10.1021/acs.biochem.1c00269.