如何高效便捷地找到安全且有效的抗體？你可能考慮過雜交瘤，噬菌體，甚至單B細胞測序。但是，你肯定沒有想到有朝一日可以從人和動物的血清多抗中通過直接蛋白測序獲得抗體序列。

血清多抗，作為蘊含高親和力抗體的寶貴資源，在生物醫(yī)藥研發(fā)、科學研究等眾多領(lǐng)域內(nèi)扮演著不可或缺的角色。然而多抗的生產(chǎn)依賴于動物，這不可避免地導(dǎo)致了其可重復(fù)性低、批次間差異大等局限性，從而限制了其廣泛應(yīng)用。因此，精準鑒定血清多抗中的抗體序列，復(fù)現(xiàn)原始多抗的優(yōu)異性能，是抗體試劑領(lǐng)域研究人員一直希望實現(xiàn)的目標。

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)從頭測序技術(shù)，在單抗的研究中已取得顯著進展并獲得了廣泛應(yīng)用。然而，在應(yīng)對血清多抗的高度復(fù)雜性時，該技術(shù)的應(yīng)用仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。盡管已有研究投入了大量努力，試圖開發(fā)從人血清多抗中有效篩選和鑒定抗體的方法，但迄今為止，這些研究尚未能突破技術(shù)瓶頸，實現(xiàn)預(yù)期的成功。

Rapid Novor（快序生物）是蛋白從頭測序技術(shù)的全球領(lǐng)跑者。2024年10月10日，Rapid Novor的研究團隊在Nature Communications期刊發(fā)表了題為：De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination的研究論文^[1]。

該研究開發(fā)了一種融合傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學和從頭測序技術(shù)的創(chuàng)新性方法，成功從接種SARS-CoV-2疫苗的人類血清多抗中精準鑒定到了一系列中和抗體，尤為值得一提的是，其中大部分是通過傳統(tǒng)的B細胞測序技術(shù)無法獲得的抗體序列。這一成果不僅展示了這種新方法從復(fù)雜的血清多抗中高效篩選抗體的可行性和巨大潛力，也是國際上首次發(fā)表對一個復(fù)雜蛋白體系的成功測序，具有重要的科學價值。

    抗體作為高度特異性的分子，對生物治療和診斷檢測領(lǐng)域具有極大吸引力。而傳統(tǒng)的抗體篩選方法存在諸多問題，限制了其廣泛應(yīng)用：比如雜交瘤篩選周期長，得到的抗體需要人源化；而噬菌體展示技術(shù)流程復(fù)雜、篩選片段長度有限等。

單B細胞測序技術(shù)是近年來比較流行的抗體發(fā)現(xiàn)策略，它利用每個B細胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，通過對免疫動物的B細胞進行單細胞測序，可以高通量獲得天然輕重鏈配對的抗體序列。這看起來是一項很完美的技術(shù)，但仍存在一些不足之處。最重要的一點是，雖然B細胞測序可以有效發(fā)現(xiàn)抗體，但在血液中分泌抗體的漿細胞極少，且存活時間短，因此對外周B細胞的研究無法捕捉外周抗體的全部多樣性。

與此相反，各個器官的B細胞產(chǎn)生的多克隆抗體pAbs（特別是IgG）在血液循環(huán)中含量豐富，且半衰期長。根據(jù)研究估算，通過外周血單B細胞測序發(fā)現(xiàn)的抗體可能只有約2%與循環(huán)IgG匹配。此外，血清中循環(huán)的抗體經(jīng)過了免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)的雙重篩選，其安全性和有效性更有保障。因此，從血清中直接富集多抗進行從頭測序，是獲得優(yōu)質(zhì)治療性抗體的有效途徑。

在這項最新研究中，研究團隊巧妙地融合了多種分析技術(shù)，建立了血清多抗的測序流程。這些技術(shù)涵蓋了蛋白分離、非還原條件下蛋白消化、從頭測序（de novo sequencing）、自下而上（bottom-up）蛋白組學、多肽化學、w離子測定、自中而下（middle-down）蛋白組學、非標記定量蛋白組學、重鏈-輕鏈配對等。通過這一系列精心設(shè)計的步驟，研究團隊成功實現(xiàn)了降低樣本的復(fù)雜度、從頭測序獲得肽段序列、正確區(qū)分亮氨酸/異亮氨酸同分異構(gòu)體、正確拼接包括CDR區(qū)域的全長抗體單鏈、正確配對抗體的輕重鏈，最終從血清多抗中鑒定出準確的抗體序列。

在成功構(gòu)建這套測序技術(shù)流程后，研究團隊首先對來自三名疫苗接種者的血漿樣本中的抗體進行了評估，選擇了對SARS-CoV-2受體結(jié)合域（RBD）展示出最優(yōu)親和力的接種者抗體進行測序，共獲得了12個抗體序列。

進一步分析結(jié)果顯示，在所發(fā)現(xiàn)的這些抗體序列中，有6個抗體序列對RBD的親和力與原始多抗相當（PD124），而且它們在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2（ACE2）競爭結(jié)合實驗和假病毒中和實驗中均展現(xiàn)出對SARS-CoV-2的中和能力。

尤為值得一提的是，在這6個抗體序列中，有4個（R5, R6, R11, R12）是完全通過從頭測序技術(shù)獨立獲得的，彰顯了使用該技術(shù)流程高效、精準地從復(fù)雜的血清多抗中鑒定出高活性抗體序列的卓越能力。

綜上所述，本研究成功克服了多抗測序的諸多困難，建立起一套切實可行的技術(shù)方案，實現(xiàn)了人血清多抗的從頭測序，并且通過實例證明了這一方案可以發(fā)現(xiàn)與原始多抗活性相似的抗體序列。這一研究不僅凸顯了多抗從頭測序技術(shù)的獨特價值，還展示了該技術(shù)用于探索單B細胞測序技術(shù)無法觸及領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景，比如深入理解動物和人體復(fù)雜的免疫應(yīng)答機制。

本文的第一作者，Rapid Novor（快序生物）公司負責多抗測序項目（REpAb）的首席科學家Thierry Le Bihan博士表示：“我們的技術(shù)將從頭測序與蛋白質(zhì)組學相結(jié)合，因此能夠發(fā)現(xiàn)更多樣的抗體。我們發(fā)現(xiàn)的一些抗體可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但在傳統(tǒng)的分析策略中往往被忽視。蛋白從頭測序在全面、深入挖掘抗體資源方面顯示出非凡的潛力，而未來方法學的發(fā)展將推動該領(lǐng)域取得更大進步?！敝两馬apid Novor（快序生物）團隊已經(jīng)成功完成了超過100個多抗測序項目，并保持了100%的成功率。他們正在積極攜手全球TOP制藥公司和生物技術(shù)公司，將REpAb技術(shù)整合至高價值抗體開發(fā)的關(guān)鍵工作流程中。

Rapid Novor（快序生物）董事長兼首席科學家馬斌博士為論文通訊作者。馬斌博士是加拿大滑鐵盧大學計算機系教授，是基于質(zhì)譜對蛋白質(zhì)進行從頭測序（de novo sequencing）領(lǐng)域的主要奠基人之一。他先后主導(dǎo)了該領(lǐng)域的第一代和第二代從頭測序算法的開發(fā)，完成了抗體蛋白從頭測序技術(shù)從0到1的突破。此次他帶領(lǐng)研究團隊首次報道了從接種SARS-CoV-2疫苗的人類血清多抗中直接測得中和抗體，標志著Rapid Novor（快序生物）在蛋白從頭測序技術(shù)領(lǐng)域的絕對領(lǐng)導(dǎo)地位。

Rapid Novor（快序生物）目前在中國提供基于血清多抗直接測序的抗體發(fā)現(xiàn)服務(wù)，如需了解更多詳情，敬請關(guān)注公眾號與我們聯(lián)系。

參考文獻

[1] Le Bihan T, Nunez de Villavicencio Diaz T, Reitzel C, Lange V, Park M, Beadle E, Wu L, Jovic M, Dubois RM, Couzens AL, Duan J, Han X, Liu Q, Ma B. De novo protein sequencing of antibodies for identification of neutralizing antibodies in human plasma post SARS-CoV-2 vaccination. Nat Commun. 2024 Oct 10;15(1):8790. doi: 10.1038/s41467-024-53105-8. PMID: 39389968.