摘要：

腫瘤的早期診斷至關(guān)重要，可以提升治療的成功率和患者的存活率。無創(chuàng)液體活檢技術(shù)有望通過檢測體液標志物以發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測腫瘤的動態(tài)變化，然而目前該技術(shù)的應用受到檢測方法敏感性和特異性不足等因素的限制。細胞游離DNA（cfDNA）是由細胞釋放至血液中的降解DNA片段，其中包含少量循環(huán)腫瘤 DNA（ctDNA），因此血液中ctDNA的檢測作為非侵入性的癌癥診斷和疾病監(jiān)測方法極具前景。然而，循環(huán)中的cfDNA豐度低，且清除速度快，使得本就含量稀少的ctDNA的檢測難上加難。這主要歸因于兩個方面：一是循環(huán)核酸酶的降解作用；二是肝臟的清除作用。在本文中，研究團隊便針對這兩條途徑提出了降低cfDNA在血液中的清除速率的策略，旨在提高液體活檢對ctDNA檢測的靈敏度。在此過程中，研究團隊通過Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測序技術(shù)獲得并改造了抗體序列（圖1）。這一研究有望為癌癥患者的護理和治療提供新的有力工具。

圖1 基于蛋白從頭測序改造抗體用于改善ctDNA的液體診斷方法

結(jié)果

抗體預處理劑保護cfDNA免受核酸酶清除

為了探究能否通過抗體來減緩體內(nèi)cfDNA的清除，研究團隊選擇了對dsDNA和單鏈DNA（ssDNA）均有較好結(jié)合能力（K_d分別為90和700 nM）的小鼠單抗35I9進行研究。在體外實驗中，35I9可以與游離/組蛋白結(jié)合的dsDNA形成復合物，并且保護dsDNA免受DNase I的清除（圖2 A B）。在體內(nèi)實驗中，研究團隊對小鼠注射了攜帶特定DNA序列的單核小體（W601），雖然35I9可以延緩血清中W601的清除，但在注射60分鐘后W601的絕對量仍較低（圖2 C D）。研究團隊推測這種現(xiàn)象是因為FcγR介導的對dsDNA-35I9復合物的清除作用。為驗證這一推測，他們同時注射了FcγR抗體，觀察到W601的含量顯著增加（圖2 C）。

為了消除抗體與FcγR的結(jié)合，研究團隊運用Rapid Novor（快序生物）的REmAb單克隆抗體從頭測序技術(shù)，解析了35I9單抗的全長氨基酸序列，并對其Fc區(qū)域進行突變。其中aST3突變在體內(nèi)實驗中對W601的保護作用最強，因而被用于后續(xù)研究（圖2 D）。體內(nèi)藥代動力學研究顯示，aST3相較于35I9，在血漿中清除速度更慢（圖2 E），在脾臟中分布更少（圖2 F）。綜上所述，這種Fc區(qū)域突變的抗體在體循環(huán)中能夠保護cfDNA免受核酸酶清除，增加血漿中回收的cfDNA量。

圖2 抗體預處理劑結(jié)合cfDNA并減緩其在健康小鼠中的清除

抗體預處理劑改善腫瘤液體活檢效果

接下來研究團隊進一步探究改造后的抗體aST3是否能夠改善腫瘤的液體活檢效果。團隊建立了Luc-MC26細胞肺轉(zhuǎn)移腫瘤小鼠模型，在造模第2周單次注射不同劑量的aST3抗體，2小時后抽血檢測cfDNA和ctDNA（圖3 A）。結(jié)果表明，aST3可以顯著提升血漿中回收的cfDNA（圖3 B），增加檢測到的突變分子量（圖3 C），且不影響cfDNA中腫瘤DNA占比（圖3 D）。注射aST3后可以檢測到更多ctDNA單核苷酸變異（SNVs）（圖3 E），對ctDNA的檢測靈敏度更高（圖3 F G）。

圖3 抗體在小鼠肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型中提高cfDNA的回收量

納米顆粒預處理劑改善腫瘤液體活檢效果

除了被循環(huán)的核酸酶降解外，cfDNA的另一條主要體內(nèi)清除途徑是被肝臟駐留的單核吞噬細胞（如Kupffer細胞）吞噬。體內(nèi)大部分的cfDNA是以單核小體的形式與組蛋白結(jié)合成納米顆粒。因此研究團隊提出假設，使用競爭性的納米顆粒（例如脂質(zhì)體）能夠暫時飽和這些細胞的吞噬能力，從而減少cfDNA的清除。研究團隊在體內(nèi)外水平證實了這一假設，納米顆粒能夠減少cfDNA的清除，增加它在血中的濃度，提高對微小腫瘤的檢測靈敏度。

綜上所述，本研究基于體內(nèi)cfDNA的兩條主要清除路徑，分別設計了抗體和納米顆粒預處理劑，將血液中ctDNA的回收量提高了10倍以上，顯著提升了腫瘤檢測靈敏度（圖4）。

圖4 預處理劑減少cfDNA的體內(nèi)清除并提高液體活檢的靈敏度 

關(guān)鍵點：

• ctDNA作為血液中的腫瘤標志物，在非侵入性癌癥檢測和監(jiān)測方面展現(xiàn)出了良好的應用前景，但其檢測的有效性受到cfDNA體內(nèi)降解和清除機制的限制。

• 本研究提出了一種采用無FcγR結(jié)合能力的DNA結(jié)合單抗，保護cfDNA免受核酸酶降解，從而增加血液中ctDNA回收量的方法。

• 本研究采用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測序技術(shù)獲得了目的抗體序列，并在此基礎上對Fc區(qū)域進行改造，獲得無FcγR結(jié)合能力的DNA結(jié)合單抗aST3。

• aST3使荷瘤小鼠血液中的ctDNA回收量提高了10倍以上，增強了腫瘤液體活檢的靈敏度。

參考資料

1. Martin-Alonso C, Tabrizi S, Xiong K, Blewett T, Sridhar S, Crnjac A, Patel S, An Z, Bekdemir A, Shea D, Wang ST, Rodriguez-Aponte S, Naranjo CA, Rhoades J, Kirkpatrick JD, Fleming HE, Amini AP, Golub TR, Love JC, Bhatia SN, Adalsteinsson VA. Priming agents transiently reduce the clearance of cell-free DNA to improve liquid biopsies. Science. 2024 Jan 19;383(6680):eadf2341. doi: 10.1126/science.adf2341.

2. https://www.rapidnovor.com/priming-agents-cell-free-dna/