摘要：

T細胞惡性腫瘤是源于T淋巴細胞的惡性疾病，現(xiàn)有的療法常面臨復發(fā)和脫靶毒性等問題。因此，開發(fā)既有效又安全的免疫療法對于T細胞惡性腫瘤的治療具有重要的臨床價值。盡管已有報道稱嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法取得了一定成效，但其可能導致健康T細胞的耗竭，從而加劇患者免疫力下降引發(fā)感染的風險。本文研究團隊開發(fā)了一種新策略，旨在不損害健康T細胞的同時，精準治療T細胞惡性腫瘤（圖1）。

首先，研究團隊對T細胞淋巴瘤患者的T細胞受體（TCR）進行了深入分析，發(fā)現(xiàn)惡性細胞常表達一種特定的T細胞受體β鏈可變區(qū)（TRBV）克隆TRBV20-1（Vβ2）?；诖税l(fā)現(xiàn)，研究團隊提出假設(shè)：開發(fā)靶向這些惡性腫瘤中主要的TRBV的免疫療法，可以實現(xiàn)對腫瘤T細胞的精準治療。

為了驗證此假設(shè)，研究團隊利用快序生物（Rapid Novor）的蛋白從頭測序技術(shù)（REmAb），成功解析了一種鼠源Vβ2抗體（MPB2D5）的全長氨基酸序列。隨后，通過工程化改造，設(shè)計了CAR構(gòu)建體（CAR-Vβ2）并進行了人源化處理。這種工程化T細胞在體內(nèi)外實驗中均展示出對Vβ2⁺惡性T細胞的特異性清除能力。

此外，研究團隊還開發(fā)了一種基于抗體依賴性細胞毒性（ADCC）的自然殺傷（NK）細胞療法。研究團隊通過在Vβ2抗體中引入Fc突變并對生產(chǎn)抗體的細胞系進行改造，獲得了具有增強的ADCC活性的去巖藻糖基化抗體，為T細胞惡性腫瘤的治療又提供了一個有力工具。

圖1 基于蛋白從頭測序技術(shù)的T細胞瘤免疫療法開發(fā)流程

結(jié)果

構(gòu)建靶向惡性T細胞上TCR Vβ2⁺的CAR-T細胞

研究團隊首先使用一系列Vβ特異性抗體分析了72名患者的皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）細胞中的TRBV，發(fā)現(xiàn)其中Vβ2（TRBV20-1）最為常見（圖2 a）。通過流式細胞術(shù)和單細胞測序分析一名Vβ2⁺Sézary綜合征(SS)患者的細胞，也證實了這一結(jié)論（圖2 b）。這些結(jié)果提示，靶向Vβ2的免疫療法可能治療CTCL，同時最大限度維持患者正常的免疫功能。為了構(gòu)建靶向治療策略，研究團隊利用快序生物（Rapid Novor）的蛋白從頭測序技術(shù)（REmAb）獲得了Vβ2抗體的準確全長氨基酸序列，并進行改造，用于CAR-T的構(gòu)建（mCAR-Vβ2）。起初，團隊嘗試使用患者的自身T細胞構(gòu)建CAR-T，但其轉(zhuǎn)染效率和CAR表達水平都低于健康供體T細胞，且對Vβ2⁺CTCL細胞的殺傷作用也較弱。因此，團隊轉(zhuǎn)向探索利用健康供體T細胞獲得現(xiàn)貨型同種異體mCAR-Vβ2 T細胞，用于CLTL治療的可行性。為了減少CAR-T治療可能引起的移植物抗宿主反應（GVH），研究團隊敲除了健康供體T細胞上的TRAC/B2M/CIITA基因，構(gòu)建了mCAR-Vβ2 T細胞。這種三重基因敲除的工程化T細胞可以在高效殺傷Vβ2⁺CTCL細胞的同時，不殺傷正常細胞（圖2 c-f）。

圖2 構(gòu)建靶向TCR-Vβ2的mCAR-T細胞

同種異體的mCAR-Vβ2 T細胞可以發(fā)揮高效特異的體內(nèi)抗腫瘤作用

接下來，研究團隊構(gòu)建了Vβ2⁺外周T細胞淋巴瘤（PTCL）的人源性腫瘤異種移植（PDX）小鼠模型來評價mCAR-Vβ2 T細胞的體內(nèi)抗腫瘤效果（圖3 a）。mCAR-Vβ2 T細胞治療后，在小鼠的骨髓、脾臟和外周血中均顯著殺傷Vβ2⁺ PTCL細胞，而不影響Vβ2^-正常細胞的存活（圖3b-i）。

圖3 同種異體mCAR-T細胞的體內(nèi)抗腫瘤作用

CAR-Vβ2 T細胞的人源化改造

為了拓展mCAR-Vβ2 T細胞的臨床應用前景，研究團隊對其進行了進一步的人源化改造，共獲得24個候選分子。其中最優(yōu)的分子hCAR-Vβ2被用于后續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤作用研究。hCAR-Vβ2在Vβ2⁺ CTCL PDX小鼠模型上表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤作用和安全性，表明這種人源化策略成功保留了mCAR-Vβ2 T細胞的腫瘤細胞特異性靶向識別和殺傷效率,同時大幅降低了其免疫原性,為臨床應用提供了良好的基礎(chǔ)。

CRISPR-AAV系統(tǒng)用于CAR-Vβ2工程化改造

       上述研究中使用慢病毒系統(tǒng)遞送CAR，存在基因組隨機整合的風險。因此為了減少CAR-T療法在臨床應用中的潛在安全隱患，進一步拓展其臨床應用價值，研究團隊構(gòu)建了CRISPR-AAV系統(tǒng)用于CAR的遞送和精準整合（圖4 a）。結(jié)果表明，CRISPR-AAV構(gòu)建的hCAR-Vβ2 T細胞在患者惡性T細胞的體內(nèi)外模型中均表現(xiàn)出對Vβ2⁺惡性T細胞的特異性殺傷作用（圖4b-k）。由于患者原發(fā)的惡性T細胞在小鼠體內(nèi)無法長期存活，研究團隊又使用一種穩(wěn)定表達熒光素酶的Jurkat-TRBV20-1細胞建立長期的PDX小鼠腫瘤模型。結(jié)果表明，無論是慢病毒還是CRISPR-AAV系統(tǒng)構(gòu)建的hCAR-Vβ2 T細胞，在長達30天的時間內(nèi)都可顯著抑制腫瘤的生長，延長小鼠的生存率，且不會導致小鼠體重減輕，表現(xiàn)出了良好的安全性（圖4 n-q）。

圖4 CRISPR-AAV系統(tǒng)構(gòu)建CAR-Vβ2 T細胞的抗腫瘤作用

篩選用于同種異體hCAR-Vβ2 T細胞擴增分化的細胞因子組合

為了篩選體外構(gòu)建hCAR-Vβ2 T細胞的細胞培養(yǎng)條件，研究團隊探索了20種細胞因子組合對CAR-T構(gòu)建和功能的影響。其中IL7、IL15和IL12的組合可以同時促進CAR-T的擴增、分化，維持它的殺傷能力。

增強ADCC功能的人源化Vβ2抗體用于Vβ2⁺T細胞惡性腫瘤治療

由于不同臨床階段的患者需要不同的治療方法，例如某些類型和階段的TCL患者更適合治療性抗體，而不是CAR-T療法。因此團隊開發(fā)了一種基于人源化Vβ2抗體和異體NK細胞的ADCC平臺。研究團隊首先在人源化Vβ2 IgG1抗體（h-anti-Vβ2）的Fc區(qū)引入突變，接著在生產(chǎn)抗體的細胞系中敲除Fut8基因用來消除抗體的巖藻糖基化翻譯后修飾，從而增強了其ADCC的活性。體外實驗表明，優(yōu)化后的h-anti-Vβ2 IgG1抗體表現(xiàn)出良好的NK細胞介導的ADCC殺傷Vβ2⁺ CTCL細胞的作用，且同時不殺傷正常細胞。這種方法可以作為CAR-T細胞療法的補充，更好地滿足臨床需求。

關(guān)鍵點

l  研究團隊開發(fā)了一種靶向T細胞惡性腫瘤特有TCR克隆的療法，實現(xiàn)了精準殺傷腫瘤細胞的同時，不殺傷其他正常細胞。

l  借助快序生物（Rapid Novor）的REmAb蛋白從頭測序技術(shù)，研究團隊獲得了Vβ2 抗體的全長精準氨基酸序列，并將其用于CAR-T和ADCC療法的開發(fā)。

l  人源化的CAR-Vβ2 T細胞在體內(nèi)外均表現(xiàn)出對Vβ2⁺惡性T細胞的特異性清除作用，展現(xiàn)出良好的臨床應用前景。

參考資料

1. Ren J, Liao X, Lewis JM, Chang J, Qu R, Carlson KR, Foss F, Girardi M. Generation and optimization of off-the-shelf immunotherapeutics targeting TCR-Vβ2+ T cell malignancy. Nat Commun. 2024 Jan 15;15(1):519. doi: 10.1038/s41467-024-44786-2.

2. https://www.rapidnovor.com/immunotherapeutics-targeting-tcell-malignancy/