摘要：

單克隆抗體（單抗）是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中必不可少的試劑和工具，其傳統(tǒng)生產(chǎn)的方法依賴于雜交瘤細(xì)胞。研究人員希望獲得有良好可重復(fù)性的單抗，但雜交瘤細(xì)胞并不穩(wěn)定也很脆弱，使得通過這種方法生產(chǎn)的單抗存在質(zhì)量不可控的風(fēng)險。例如可能會發(fā)生突變、產(chǎn)生額外的抗體鏈，甚至因雜交瘤細(xì)胞死亡導(dǎo)致抗體永久丟失。此外，當(dāng)前市場上商業(yè)化抗體的標(biāo)準(zhǔn)驗證體系尚不完善，這常常使研究人員陷入研究結(jié)果的可重復(fù)性危機，使科學(xué)研究的可信度和效率面臨挑戰(zhàn)。

重組抗體表達技術(shù)是解決抗體在生產(chǎn)、儲存、及應(yīng)用過程中所遇問題的有效策略。而使用該技術(shù)的最重要先決條件便是要了解原始抗體的完整氨基酸序列，這通?？梢酝ㄟ^雜交瘤測序和蛋白從頭測序?qū)崿F(xiàn)。雜交瘤細(xì)胞測序直接解析雜交瘤細(xì)胞系中的抗體基因序列，因此依賴于雜交瘤細(xì)胞。而蛋白從頭測序則獨辟蹊徑，直接對抗體蛋白進行測序，獲得準(zhǔn)確序列，不需要任何的基因信息。因此在雜交瘤細(xì)胞丟失或死亡時，蛋白從頭測序技術(shù)是復(fù)現(xiàn)抗體的最好方法。

本文中的研究團隊設(shè)計并闡述了獲得重組單克隆抗體和抗體片段的詳細(xì)策略。他們首先使用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測序技術(shù)和雜交瘤測序技術(shù)，獲得了一系列靶向細(xì)胞有絲分裂過程中動粒相關(guān)復(fù)合物的抗體序列。然后，對這些序列進行重組表達，并對抗體進行工程化改造。他們不僅實現(xiàn)了抗體的種屬轉(zhuǎn)換，還制備出多樣化的抗體片段（scFvC、scFv、Fab），并成功將抗體片段逆向構(gòu)建為全長抗體。結(jié)果表明，所有獲得的重組抗體和抗體片段均顯示出與有絲分裂細(xì)胞中動粒的強結(jié)合能力，展示了通過這種策略獲得重組抗體的有效性和靈活性。

重組抗體憑借其卓越的可重復(fù)性和可操作性等優(yōu)勢，在生物與醫(yī)藥研究領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。本研究展示了一種利用先進的蛋白從頭測序技術(shù)，快速獲得重組表達抗體的方法。同時這種方法具有出色的普適性，可以靈活應(yīng)用于任何抗體的改造研究中，為抗體研究領(lǐng)域注入新活力。

圖1 利用REmAb蛋白從頭測序技術(shù)獲得抗體序列用于工程化改造和重組表達

結(jié)果

制備靶向有絲分裂相關(guān)靶點的重組單抗

本文中，研究團隊通過對有絲分裂中的一系列關(guān)鍵蛋白的特異性抗體進行測序、改造、重組表達，充分展示該抗體生產(chǎn)流程的有效性、靈活性以及普適性。首先，研究團隊對已經(jīng)報道的Hec1抗體“9G3”，通過Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測序技術(shù)獲得了抗體的精確全長序列（圖2 A-B），并進行重組表達（圖2 C-D）。在HeLa細(xì)胞上的免疫熒光實驗證實，測序后重組表達的rMAb--Hec1^ms在有絲分裂的各個時期均可識別動粒（圖2 E），且該作用是Hec1特異的（圖2 F-G）。通過該技術(shù)流程，研究團隊同時測序并重組表達驗證了KNL1的磷酸化抗體（pMELT）、CENP-C抗體。研究團隊還通過對雜交瘤細(xì)胞測序，獲得并重組表達驗證了BubR1、Mad2抗體。

圖2 重組表達Hec1單克隆抗體

改造抗體的種屬

在間接免疫熒光實驗中，為有效檢測和放大信號，需要使用熒光標(biāo)記的二抗來識別一抗。然而商業(yè)化的一抗種屬通常有限，制約了標(biāo)記二抗的選擇和該方法的應(yīng)用。因此研究團隊接下來便基于測序和重組表達技術(shù)，對抗體的種屬進行改造。他們將先前獲得的 rMAb--Hec1^ms的恒定區(qū)轉(zhuǎn)換為兔IgG的恒定區(qū)（圖3 A），獲得了rMAb--Hec1^rb。改造后的抗體保留了對動粒的識別能力，且被兔二抗識別，不再被鼠二抗識別（圖3 B）。此外，研究團隊還用類似的策略，對上述測序獲得的抗體序列進行了人源化改造（圖3 C-F），進一步拓寬了這些抗體的應(yīng)用范圍和潛力。

圖3 通過重組表達技術(shù)改造抗體的種屬

獲得重組抗體片段

對于某些細(xì)胞生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用場景，抗體片段相較于完整抗體展現(xiàn)出更優(yōu)的應(yīng)用潛力。研究團隊接下來便展示了如何從已獲取的抗體序列出發(fā)，獲得scFvC、scFv和Fab抗體片段（圖4 A）。進一步通過多種實驗手段驗證了它們結(jié)合靶標(biāo)的活性和特異性：包括免疫熒光（scFvC，圖4 B-E）、GFP標(biāo)簽融合表達（scFv，圖4 F）、熒光染料標(biāo)記（Fab，圖4 G-H）。

圖4 基于全長抗體獲得抗體片段

對抗體片段反向工程化獲得全長抗體

在間接免疫熒光試驗中，全長抗體的恒定區(qū)起到重要作用，它能夠被二抗識別，實現(xiàn)信號的放大和靈敏度的提升。因此研究團隊展示了如何從識別HA標(biāo)記的scFv抗體片段出發(fā)，獲得全長的抗體（rMAb--HA^rb，圖5 A）。為了在細(xì)胞中測試抗體并驗證其特異性，研究團隊在Hela細(xì)胞中分別表達了HA標(biāo)記的Hec1（圖5 B）、HA和GFP標(biāo)記的Hec1（圖5 C）、GFP標(biāo)記的Hec1（圖5 D）。結(jié)果表明rMAb--HA^rb可以識別表達Hec1--HA和Hec1--HA-GFP，而非Hec1-GFP的細(xì)胞。通過類似的方法，研究團隊將α tubulin的scFvC抗體片段轉(zhuǎn)化成了全長抗體，并通過實驗證實了其不僅保留了原有的抗原特異性，還能夠被兔二抗特異性識別（圖5 E-F）。

圖5 從抗體片段出發(fā)獲得全長抗體

關(guān)鍵點

1. 對抗體進行蛋白從頭測序后重組表達，可以解決傳統(tǒng)的雜交瘤抗體制備中面臨的諸多挑戰(zhàn)和限制。

2. 本文研究團隊開發(fā)了一種通用的生成重組單克隆抗體和抗體片段的方法，可應(yīng)用于任何抗體的改造研究中。

3. 利用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測序技術(shù)獲得的重組單克隆抗體顯示出了對靶標(biāo)蛋白的強結(jié)合能力。

參考資料

1.      DeLuca KF, Mick JE, Ide AH, Lima WC, Sherman L, Schaller KL, Anderson SM, Zhao N, Stasevich TJ, Varma D, Nilsson J, DeLuca JG. Generation and diversification of recombinant monoclonal antibodies. Elife. 2021 Dec 31;10:e72093

2.      https://www.rapidnovor.com/generation-and-diversification-of-recombinant-monoclonal-antibodies