引言

  抗體（Abs）作為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中不可缺少的工具，其可靠性對于確保研究結(jié)果的可重復(fù)性至關(guān)重要。然而，通過動物生產(chǎn)的單克隆抗體（mAb）和多克隆抗體（pAb）往往存在批次間差異大的問題，嚴(yán)重影響抗體的質(zhì)量和性能的穩(wěn)定性。使用抗體測序和重組表達(dá)技術(shù)是克服可重復(fù)性挑戰(zhàn)的有效策略，助力mAb和pAb的穩(wěn)定化和可靠化生產(chǎn)。

雜交瘤的不穩(wěn)定性導(dǎo)致單克隆抗體可重復(fù)性差

       雜交瘤技術(shù)是生產(chǎn)單克隆抗體（mAb）最經(jīng)典且廣泛應(yīng)用的方法之一，該技術(shù)流程涉及使用抗原免疫的動物，從脾臟中分離出分泌抗體的B細(xì)胞，隨后將其與骨髓瘤融合，以獲得可穩(wěn)定且持續(xù)生產(chǎn)抗原特異性mAb的永生化雜交瘤細(xì)胞系。然而使用雜交瘤生產(chǎn)抗體在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨多重挑戰(zhàn)，導(dǎo)致其在免疫分析和體外診斷（IVD）中應(yīng)用的可重復(fù)性和可靠性不高。

具體而言，當(dāng)出現(xiàn)支原體或其他類型的細(xì)胞污染時，雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的mAb質(zhì)量會顯著下降。此外雜交瘤細(xì)胞可能存在的遺傳漂變和額外鏈也會影響mAb的結(jié)合特性。根據(jù)一項評估185個雜交瘤細(xì)胞系的研究顯示，其中超過30%的雜交瘤抗體存在額外輕鏈或重鏈，并且該現(xiàn)象會顯著降低抗體的特異性和親和力 ^[1]。此外，雜交瘤細(xì)胞存在死亡或意外丟失的風(fēng)險，這給抗體在免疫分析和IVD領(lǐng)域的持續(xù)可靠應(yīng)用帶來了不確定性。

多克隆抗體的批次間差異

多克隆抗體（pAbs）憑借其多表位結(jié)合的特性，在某些應(yīng)用領(lǐng)域中展現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢。然而pAbs是通過用抗原刺激動物，引發(fā)免疫反應(yīng)和親和力成熟過程，隨后進(jìn)行血漿分離、親和富集純化獲得的復(fù)雜混合物。由于不同批次間免疫動物誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)存在差異，生產(chǎn)的pAbs通常存在較大的批次間差異。

更為棘手的是，一旦用于生產(chǎn)抗體的動物死亡，該pAbs就無法繼續(xù)生產(chǎn)。而重新開發(fā)新的pAbs又需要大量的研發(fā)工作和時間、成本的投入?；谶@些原因，有研究者提出了pAbs應(yīng)逐漸退出研究的觀點(diǎn)^[2]。解決這一困境的一種有潛力的策略是對pAbs進(jìn)行測序，對獲得的單抗序列進(jìn)行重組表達(dá)和組合，復(fù)現(xiàn)原始多抗的性能，并實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定可控的生產(chǎn)。

抗體測序和重組表達(dá)確?？贵w試劑的可重復(fù)性

使用蛋白從頭測序技術(shù)來精確解析mAbs和pAbs的氨基酸序列，并對獲得的序列進(jìn)行重組表達(dá)，是獲得可重復(fù)性抗體的一種可靠策略（圖1）。

圖1 使用從頭抗體測序和重組表達(dá)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)單克隆抗體（mAbs）和多克隆抗體（pAbs）的可重復(fù)生產(chǎn)。

單抗測序

蛋白從頭測序技術(shù)是一種基于質(zhì)譜的蛋白序列分析手段，通過該技術(shù)僅使用少量的蛋白樣品，便可對mAbs的全長進(jìn)行精準(zhǔn)測序。快序生物的REmAb單抗從頭測序技術(shù)可以獲得包括CDRs的100%準(zhǔn)確的完整抗體序列，并且完全不依賴于任何細(xì)胞系或基因信息。使用REmAb技術(shù)對mAbs進(jìn)行測序，研究人員不僅可以重新獲得因雜交瘤細(xì)胞系丟失、死亡、突變等原因無法繼續(xù)生產(chǎn)的抗體，還可以對抗體進(jìn)行重組表達(dá)，使抗體的生產(chǎn)擺脫對雜交瘤細(xì)胞系的依賴。

多抗測序

從頭測序技術(shù)同樣適用于復(fù)雜的pAbs混合物，可以從中發(fā)現(xiàn)能夠重現(xiàn)原始pAbs結(jié)合特性的mAbs全長序列?？煨蛏锏腞EpAb多抗測序技術(shù)可以對直接免疫動物血清多抗進(jìn)行測序，并且無任何種屬限制。通過該技術(shù)獲得的抗體序列可以組合成重組表達(dá)單抗的混合物，以重現(xiàn)原始多抗的性能和穩(wěn)定生產(chǎn)。

重組表達(dá)

重組抗體（rAbs）技術(shù)使用基因工程和表達(dá)系統(tǒng)，可以穩(wěn)定生產(chǎn)高質(zhì)量的抗體。該技術(shù)首先使用蛋白從頭測序技術(shù)獲得mAbs和pAbs的抗體序列。隨后將抗體輕鏈和重鏈基因分別插入兩個質(zhì)粒，然后共轉(zhuǎn)染到表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞系）中，利用宿主細(xì)胞生產(chǎn)所需的抗體。接下來，可以使用Protein A/G和/或親和純化的方法對抗體進(jìn)行純化，并進(jìn)行表征以評估抗體性能。哺乳動物細(xì)胞（如CHO細(xì)胞或HEK293細(xì)胞）因有卓越的蛋白質(zhì)折疊能力和翻譯后修飾（如糖基化）能力，成為大多數(shù)rAbs重組表達(dá)的首選宿主細(xì)胞。通過這一系列流程可以生產(chǎn)高質(zhì)量的，與天然免疫系統(tǒng)中抗體相似的rAbs，為科學(xué)研究、疾病診斷和治療等領(lǐng)域提供強(qiáng)有力的支持。

結(jié)語

       綜上所述，使用蛋白從頭測序技術(shù)和重組表達(dá)技術(shù)，我們可以有效應(yīng)對抗體的可重復(fù)性危機(jī)?？煨蛏铮≧aipd novor）作為蛋白從頭測序技術(shù)的全球領(lǐng)跑者，其創(chuàng)新的REmAb單抗和REpAb多抗測序技術(shù)可以高效且準(zhǔn)確地從單抗和血清多抗中測得抗體序列，助力抗體行業(yè)快速發(fā)展。

參考資料

1.  Bradbury ARM, et al. When monoclonal antibodies are not monospecific: Hybridomas frequently express additional functional variable regions. MAbs. 2018 May/Jun;10(4):539-546. doi: 10.1080/19420862.2018.1445456.

2.  Bradbury A, Plückthun A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 2015 Feb 5;518(7537):27-9. doi: 10.1038/518027a.

3.  https://www.rapidnovor.com/life-science-reproducability/