摘要
干擾素-γ(IFN-γ)是一種關(guān)鍵的效應(yīng)細胞因子,具有抗增殖、促凋亡和抗腫瘤的特性。它由活化的T細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和自然殺傷T細胞(NKT細胞)在腫瘤環(huán)境中產(chǎn)生,標志著免疫系統(tǒng)的活躍程度。因此成像和檢測IFN-γ生物標志物是監(jiān)測抗腫瘤治療效果及免疫信號傳導(dǎo)效應(yīng)的有效手段。本文研究團隊之前開發(fā)了一種基于單克隆抗體(mAb)的放射性示蹤劑,用于通過免疫正電子發(fā)射斷層掃描(immunoPET)對IFN-γ進行成像和檢測。然而,全長mAb的大小可能會限制其腫瘤穿透能力,從而無法準確描繪免疫反應(yīng),限制其應(yīng)用效果。
因此,本文中研究者設(shè)計、生產(chǎn)并表征了四種基于雙鏈抗體(Db)的放射性示蹤劑。它們體積較小,可以迅速積累在腫瘤內(nèi),實現(xiàn)對IFN-γ的靶向免疫PET成像(圖1)。首先,研究者利用快序生物(Rapid Novor)的REmAb抗體蛋白從頭測序服務(wù)獲取了單抗的完整序列。接下來利用測得的序列,研究者通過在VH-VL之間加入不同長度的肽段連接子(7-13個氨基酸)構(gòu)建了不同的Db序列,并進行鋯-89放射性同位素標記。通過體內(nèi)外表征評價了它們的物理化學(xué)特性、組織分布和免疫反應(yīng)特性。
快序生物(Rapid Novor)的REmAb抗體蛋白從頭測序技術(shù)可以為Db和其他形式的抗體藥物的構(gòu)建和改造提供準確序列信息,確保最終抗體改造的準確性和有效性。
圖1抗體蛋白從頭測序助力雙鏈抗體IFN-γ放射性示蹤劑的開發(fā)
結(jié)果
雙鏈抗體及其放射性免疫偶聯(lián)物的表征
研究者首先通過重組表達生產(chǎn)了4種目的雙鏈抗體,并通過SDS-PAGE對純度進行測定(圖2 A),采用MALDI-TOF檢測分子量,代表性HL-11的質(zhì)譜結(jié)果見圖2 B。接下來通過異硫氰酸酯連接子將每個Db與去鐵胺(DFO)偶聯(lián),代表性的HL-11和DFO偶聯(lián)物的電噴霧電離高分辨質(zhì)譜(ESI-HRMS)結(jié)果見圖2 C。隨后對它們進行鋯-89放射性同位素標記和表征,其中HL-9因免疫反應(yīng)性較差,在后續(xù)研究中被剔除。
圖2 Db和Db-DFO偶聯(lián)物的SDS-PAGE和質(zhì)譜分析
小鼠PET成像檢測同位素標記雙鏈抗體
接下來研究者在CT26腫瘤小鼠模型中進行PET成像,觀察了放射性同位素標記的HL-7,HL-11,HL-13在腫瘤組織的聚集和在體內(nèi)的清除(圖3 A)。其中HL-7和HL-11表現(xiàn)出了類似的腫瘤組織聚集能力,而HL-13最弱(圖3 B)。
圖3 PET成像檢測Zr-89標記雙鏈抗體在腫瘤組織的聚集
在成像結(jié)束后,對動物進行安樂死,通過γ計數(shù)器檢測放射性免疫偶聯(lián)物的組織分布情況,HL-13的組織攝取程度低于HL-7和HL-11(圖4 A)。比較腫瘤/正常組織攝取藥物的比例,發(fā)現(xiàn)在肝臟、腎臟、肌肉中所有藥物的分布比率無顯著差異。但是HL-11的腫瘤/血液分布比率顯著低于HL-13,但與HL-7相當(圖4 B)。
圖4 PET成像后檢測Zr-89標記雙鏈抗體的組織分布情況
同位素標記雙鏈抗體的生物分布和競爭結(jié)合研究
接下來研究者觀察了注射后1、3、24 h三種放射性免疫偶聯(lián)物示蹤劑的組織微分布情況(圖5 A-C)。在注射后3 h它們在CT26腫瘤的分布均達到峰值,優(yōu)于先前報道的同位素標記單抗(72 h)。研究者在注射示蹤劑同時或之前,注射了未標記的Db或全長單抗(AN-18),觀察它們與示蹤劑競爭結(jié)合IFN-γ的能力。結(jié)果表明,加入Db或AN-18以后,三種示蹤劑在腫瘤組織的分布減少,表明其檢測腫瘤內(nèi)源性IFN-γ有較好的特異性(圖5 D)。綜合以上研究,研究者認為HL-11最適合開發(fā)成IFN-γ示蹤劑,但有待進一步優(yōu)化。
圖5 免疫復(fù)合物注射后的體內(nèi)微分布情況和識別腫瘤組織IFN-γ特異性
關(guān)鍵點
1. 本文研究者構(gòu)建了同位素標記雙鏈抗體示蹤劑用于腫瘤組織IFN-γ的靶向免疫PET成像,其吸收分布速度優(yōu)于先前報道的同位素標記mAb示蹤劑。
2. 本文研究者使用快序生物(Rapid Novor)的REmAb抗體蛋白從頭測序技術(shù)獲得了mAb的全長序列,并引入7-13個氨基酸長度肽鏈連接VH-VL區(qū)域構(gòu)建Db?;谫|(zhì)譜的抗體蛋白從頭測序技術(shù)可以精準獲得氨基酸序列,為工具抗體的構(gòu)建提供助力。
參考文獻
Rezazadeh F, Ramos N, Saliganan AD, Barr S, Peraino N, Schomburg F, Rancour D, Viola NT. Evaluation and selection of a lead diabody for interferon-γ PET imaging. Nucl Med Biol. 2022 Nov-Dec;114-115:162-167. doi: 10.1016/j.nucmedbio.2022.06.001. Epub 2022 Jun 17. PMID: 35753939.