摘要

干擾素-γ（IFN-γ）是一種關(guān)鍵的效應(yīng)細胞因子，具有抗增殖、促凋亡和抗腫瘤的特性。它由活化的T細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）和自然殺傷T細胞（NKT細胞）在腫瘤環(huán)境中產(chǎn)生，標志著免疫系統(tǒng)的活躍程度。因此成像和檢測IFN-γ生物標志物是監(jiān)測抗腫瘤治療效果及免疫信號傳導(dǎo)效應(yīng)的有效手段。本文研究團隊之前開發(fā)了一種基于單克隆抗體（mAb）的放射性示蹤劑，用于通過免疫正電子發(fā)射斷層掃描（immunoPET）對IFN-γ進行成像和檢測。然而，全長mAb的大小可能會限制其腫瘤穿透能力，從而無法準確描繪免疫反應(yīng)，限制其應(yīng)用效果。

因此，本文中研究者設(shè)計、生產(chǎn)并表征了四種基于雙鏈抗體（Db）的放射性示蹤劑。它們體積較小，可以迅速積累在腫瘤內(nèi)，實現(xiàn)對IFN-γ的靶向免疫PET成像（圖1）。首先，研究者利用快序生物（Rapid Novor）的REmAb抗體蛋白從頭測序服務(wù)獲取了單抗的完整序列。接下來利用測得的序列，研究者通過在VH-VL之間加入不同長度的肽段連接子（7-13個氨基酸）構(gòu)建了不同的Db序列，并進行鋯-89放射性同位素標記。通過體內(nèi)外表征評價了它們的物理化學(xué)特性、組織分布和免疫反應(yīng)特性。

快序生物（Rapid Novor）的REmAb抗體蛋白從頭測序技術(shù)可以為Db和其他形式的抗體藥物的構(gòu)建和改造提供準確序列信息，確保最終抗體改造的準確性和有效性。

圖1抗體蛋白從頭測序助力雙鏈抗體IFN-γ放射性示蹤劑的開發(fā)

結(jié)果

雙鏈抗體及其放射性免疫偶聯(lián)物的表征

研究者首先通過重組表達生產(chǎn)了4種目的雙鏈抗體，并通過SDS-PAGE對純度進行測定（圖2 A），采用MALDI-TOF檢測分子量，代表性HL-11的質(zhì)譜結(jié)果見圖2 B。接下來通過異硫氰酸酯連接子將每個Db與去鐵胺（DFO）偶聯(lián)，代表性的HL-11和DFO偶聯(lián)物的電噴霧電離高分辨質(zhì)譜（ESI-HRMS）結(jié)果見圖2 C。隨后對它們進行鋯-89放射性同位素標記和表征，其中HL-9因免疫反應(yīng)性較差，在后續(xù)研究中被剔除。

圖2 Db和Db-DFO偶聯(lián)物的SDS-PAGE和質(zhì)譜分析

小鼠PET成像檢測同位素標記雙鏈抗體

接下來研究者在CT26腫瘤小鼠模型中進行PET成像，觀察了放射性同位素標記的HL-7，HL-11，HL-13在腫瘤組織的聚集和在體內(nèi)的清除（圖3 A）。其中HL-7和HL-11表現(xiàn)出了類似的腫瘤組織聚集能力，而HL-13最弱（圖3 B）。

圖3 PET成像檢測Zr-89標記雙鏈抗體在腫瘤組織的聚集

在成像結(jié)束后，對動物進行安樂死，通過γ計數(shù)器檢測放射性免疫偶聯(lián)物的組織分布情況，HL-13的組織攝取程度低于HL-7和HL-11（圖4 A）。比較腫瘤/正常組織攝取藥物的比例，發(fā)現(xiàn)在肝臟、腎臟、肌肉中所有藥物的分布比率無顯著差異。但是HL-11的腫瘤/血液分布比率顯著低于HL-13，但與HL-7相當（圖4 B）。

圖4 PET成像后檢測Zr-89標記雙鏈抗體的組織分布情況

同位素標記雙鏈抗體的生物分布和競爭結(jié)合研究

接下來研究者觀察了注射后1、3、24 h三種放射性免疫偶聯(lián)物示蹤劑的組織微分布情況（圖5 A-C）。在注射后3 h它們在CT26腫瘤的分布均達到峰值，優(yōu)于先前報道的同位素標記單抗（72 h）。研究者在注射示蹤劑同時或之前，注射了未標記的Db或全長單抗（AN-18），觀察它們與示蹤劑競爭結(jié)合IFN-γ的能力。結(jié)果表明，加入Db或AN-18以后，三種示蹤劑在腫瘤組織的分布減少，表明其檢測腫瘤內(nèi)源性IFN-γ有較好的特異性（圖5 D）。綜合以上研究，研究者認為HL-11最適合開發(fā)成IFN-γ示蹤劑，但有待進一步優(yōu)化。

圖5 免疫復(fù)合物注射后的體內(nèi)微分布情況和識別腫瘤組織IFN-γ特異性

關(guān)鍵點

1. 本文研究者構(gòu)建了同位素標記雙鏈抗體示蹤劑用于腫瘤組織IFN-γ的靶向免疫PET成像，其吸收分布速度優(yōu)于先前報道的同位素標記mAb示蹤劑。

2. 本文研究者使用快序生物（Rapid Novor）的REmAb抗體蛋白從頭測序技術(shù)獲得了mAb的全長序列，并引入7-13個氨基酸長度肽鏈連接VH-VL區(qū)域構(gòu)建Db?；谫|(zhì)譜的抗體蛋白從頭測序技術(shù)可以精準獲得氨基酸序列，為工具抗體的構(gòu)建提供助力。

參考文獻

Rezazadeh F, Ramos N, Saliganan AD, Barr S, Peraino N, Schomburg F, Rancour D, Viola NT. Evaluation and selection of a lead diabody for interferon-γ PET imaging. Nucl Med Biol. 2022 Nov-Dec;114-115:162-167. doi: 10.1016/j.nucmedbio.2022.06.001. Epub 2022 Jun 17. PMID: 35753939.