摘要：

T細胞受體（TCR）工程化T細胞在實體瘤的治療方面潛力巨大，研究應(yīng)用前景廣闊。目前αβTCR工程化T細胞已用于臨床，但僅有少數(shù)患者能獲益。造成應(yīng)答率較低的一個重要原因是患者接受的治療產(chǎn)品中仍含有非工程化及工程化不良的T細胞。除了優(yōu)化工程化細胞，開發(fā)有效的工程化T細胞純化和治療后清除策略也將促進這些新型治療方法更好地治療患者。在本文中研究人員采用了一種策略，利用一種抗人αβTCR單克隆抗體，來實現(xiàn)工程化T細胞的純化。首先團隊發(fā)現(xiàn)這種人αβTCR的抗體能夠與人αβT細胞TCR β鏈上的表位結(jié)合。進一步的表征表明，當將人TCR β鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域3中的兩個氨基酸殘基鼠源化后，這種結(jié)合會喪失，從而實現(xiàn)工程化T細胞的純化。此外由于T細胞療法可能引起細胞因子釋放綜合征（CRS）、脫靶效應(yīng)等副作用，研究者嘗試尋找用于治療后或必須情況下體內(nèi)工程化T細胞的清除方法。他們找到了一種源自亞美尼亞倉鼠的抗小鼠TCR β鏈抗體，并進行了活性驗證和后續(xù)的人源化和抗體偶聯(lián)藥物（ADC）改造。該方法可以用于加入額外7個氨基酸位點鼠源化后的工程化T細胞清除，初步驗證了這種策略的理論可行性，但有待后續(xù)研究進一步完善。

了解抗體-抗原相互作用是工程化T細胞開發(fā)策略的關(guān)鍵。快序生物（Rapid novor）的REmAb從頭蛋白測序技術(shù)為本研究提供了抗體序列的詳細信息，為抗體和TCR的改造決策提供了重要信息。

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圖1蛋白從頭測序助力αβTCR和抗體改造

結(jié)果

抗體結(jié)合人αβT細胞的TCR β鏈的機制研究

為了實現(xiàn)非工程化和工程化不良的αβT細胞的定向清除，研究者找到了抗人αβTCR的抗體BW242/412進行研究。該抗體特異性識別人αβTCR，而不識別鼠αβTCR。通過人-鼠的TCR α鏈和β鏈配對、恒定區(qū)轉(zhuǎn)換和氨基酸替換來研究該抗體識別人αβTCR的機制。發(fā)現(xiàn)人TCR β鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域3的T110P和D112G兩個位點鼠源化后，突變的αβTCR不被該抗體識別。這為工程化T細胞純化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

表達改造αβTCR的工程化T細胞的構(gòu)建純化和活性驗證

由于外源引入的αβTCR可能與內(nèi)源αβTCR形成錯配，可能降低外源TCR的細胞表面表達和導致移植物抗宿主病(GvHD)。研究者結(jié)合了一系列策略，包括將最少關(guān)鍵氨基酸替換成鼠源、通過CD4/CD8磁性細胞分選（MACS）從PBMCs中預(yù)篩選T細胞、在TCR αβ鏈引入半胱氨酸形成二硫鍵，和將跨膜區(qū)替換為人源γδTCR，實現(xiàn)了表達目的TCR的T細胞富集（圖2 A B）。接下來研究者把抗原肽負載在T2細胞系上，刺激表達不同TCR突變體的T細胞，發(fā)現(xiàn)T細胞目的外源TCR的陽性率越高，釋放IFNγ的能力越強（圖2 C）。在兩株表達目的蛋白NY-ESO-1并遞呈目的抗原肽的腫瘤細胞系Saos-2和U226上也得到類似的結(jié)果（圖2 D），證明了通過上述流程純化的T細胞，對腫瘤細胞的識別能力更強。

圖3利用突變特異性抗體清除工程化T細胞

開發(fā)靶向引入突變區(qū)域的工程化T細胞特異性清除方法

由于工程化T細胞可能會導致細胞因子釋放綜合征、脫靶效應(yīng)等毒副作用，因此研究者想要開發(fā)一種在緊急情況下使用的工程化T細胞體內(nèi)清除方案。首先研究者試圖免疫大鼠篩選特異結(jié)合T110P+D112G的TCR β鏈最少鼠源化肽段的抗體，實現(xiàn)兩個位點突變同時完成工程化T細胞的純化和清除，然而沒有成功。

人和小鼠的TCR β鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域3共有11個氨基酸位點差異。研究者發(fā)現(xiàn)在先前引入的2個最少鼠源化位點（2/11）的基礎(chǔ)上，再引入7個鼠源化位點（9/11）的突變體可以被抗鼠TCR β鏈抗體（MuTCRβ）所識別（圖3 A B C）。由于MuTCRβ抗體來自亞美尼亞倉鼠，注入人體可能導致嚴重副作用，研究者將其恒定區(qū)轉(zhuǎn)化為人IgG1恒定區(qū)構(gòu)建人源化嵌合體，其對工程化T細胞的識別結(jié)合活性得到保留（圖3 D）。進一步，研究者把該嵌合抗體與一甲基澳瑞他汀E（MMAE）連接構(gòu)建ADC。在缺失內(nèi)源αβTCR的Jurkat-76淋巴瘤細胞中表達上述9/11鼠源化目的αβTCR后，合成的ADC藥物可以殺傷該細胞（圖3 D E）。本文初步展示了通過抗體藥物清除表達目的αβTCR的T細胞的理論可行性，但是還有待后續(xù)研究進一步的探索和完善。

圖3利用突變特異性抗體清除工程化T細胞

關(guān)鍵點

1. 本文發(fā)現(xiàn)將人TCR β鏈的2個位點氨基酸殘基鼠源化，通過已有的特異性抗體可實現(xiàn)工程化T細胞的富集。

2. 文中研究者初步探究了通過抗體改造ADC藥物實現(xiàn)工程化T細胞清除的理論可行性，未來對TCR進一步設(shè)計改造和篩選特異性抗體將助力該目標的實現(xiàn)。

3. 研究者使用了快序生物（Rapid novor）的REmAb抗體從頭測序平臺獲得了抗體序列，并對其進行人源化改造用于研究。通過質(zhì)譜對抗體進行從頭測序，可以獲得準確的序列信息，為TCR和抗體的定向改造提供指導，助力工程化T細胞療法的開發(fā)。

參考文獻

Kierkels GJJ, van Diest E, Hernández-López P, Scheper W, de Bruin ACM, Frijlink E, Aarts-Riemens T, van Dooremalen SFJ, Beringer DX, Oostvogels R, Kramer L, Straetemans T, Uckert W, Sebestyén Z, Kuball J. Characterization and modulation of anti-αβTCR antibodies and their respective binding sites at the βTCR chain to enrich engineered T cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 Jun 24;22:388-400. doi: 10.1016/j.omtm.2021.06.011.