整合素是由不同α亞基和β亞基組成的異二聚體，它們通過(guò)整合細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境來(lái)發(fā)揮諸多生理作用，例如介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移和組織形成。整合素的胞外結(jié)構(gòu)域能與其他細(xì)胞表面的配體結(jié)合，而其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域則與細(xì)胞骨架相關(guān)的銜接蛋白結(jié)合。在配體結(jié)合后，整合素會(huì)處于伸展開(kāi)放狀態(tài)，使拉力能夠穩(wěn)定整合素與細(xì)胞骨架成分之間的結(jié)合。

迄今為止，僅對(duì)RGD（含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列配體）結(jié)合類整合素（如αvβ3）進(jìn)行了單分子水平的力學(xué)研究。研究表明，結(jié)合RGD的整合素使細(xì)胞鋪展所需的張力閾值超過(guò)約40pN。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)不同整合素亞型展開(kāi)研究，發(fā)現(xiàn)與RGD結(jié)合類整合素相比，整合素α4β1亞型激活細(xì)胞鋪展所需的張力閾值明顯更低，揭示了不同整合素亞型發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的力學(xué)特征存在差異。

本研究中團(tuán)隊(duì)使用了Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測(cè)序技術(shù)獲得了αv整合素的抗體13C2的全長(zhǎng)氨基酸序列，將其重組表達(dá)后構(gòu)建了分子探針，成功用于活細(xì)胞成像和免疫染色（圖1）。

圖1 抗體測(cè)序助力構(gòu)建用于細(xì)胞成像的熒光探針

相關(guān)結(jié)果

抗體測(cè)序用于構(gòu)建熒光標(biāo)記Fab分子探針

為了在細(xì)胞水平對(duì)整合素進(jìn)行標(biāo)記與成像，研究團(tuán)隊(duì)將β1E（伸展構(gòu)象）、β1EO（活化構(gòu)象）、α4、αv整合素對(duì)應(yīng)的抗體使用papain酶切成Fab片段，然后使用熒光染料Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647 NHS Ester標(biāo)記。其中αv整合素的抗體13C2序列由Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測(cè)序技術(shù)獲得。接下來(lái)，將人成纖維細(xì)胞BJ-5ta接種在帶有RGD-54pN（結(jié)合RGD的整合素的配體）或LDVP-54pN（整合素α4β1的配體）張力計(jì)量器的玻片表面，測(cè)量了這些標(biāo)記后的Fab與細(xì)胞的結(jié)合和解離速率（圖2 a-d）。結(jié)果表明，這些標(biāo)記后的Fab可以滿足實(shí)時(shí)細(xì)胞成像的需求（圖2 e）。

圖2 熒光標(biāo)記Fab與細(xì)胞表面整合素的結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究

熒光探針檢測(cè)整合素的空間分布和構(gòu)象狀態(tài)

在成功構(gòu)建和測(cè)試了這些標(biāo)記Fab分子探針后，研究團(tuán)隊(duì)借助它們對(duì)細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像研究。在細(xì)胞與RGD-54pN接觸的表面上，整合素αV成簇分布于細(xì)胞邊緣附近。αV在細(xì)胞邊緣和細(xì)胞腹側(cè)應(yīng)力纖維的末端，與細(xì)胞骨架中的肌動(dòng)蛋白束相連，形成了粘附斑（圖3 a）。在細(xì)胞與LDVP-54pN接觸的表面上，整合素α4并沒(méi)有形成類似的簇狀分布，而是形成分散的小簇。同時(shí)，也未觀察到明顯的腹側(cè)應(yīng)力纖維（圖3 b）。整合素αV和α4在兩個(gè)表面上的分布均不重合（圖3 c）。樁蛋白作為一種細(xì)胞骨架銜接蛋白，在兩個(gè)表面上整合素αV和α4黏著斑中均有分布（圖3 d）。利用這些標(biāo)記Fab，還能實(shí)現(xiàn)對(duì)低親和力閉合狀態(tài)（C、BC和EC）和高親和力開(kāi)放狀態(tài)（EO）的β1整合素在細(xì)胞表面的空間分布進(jìn)行測(cè)定（圖3 e f）。結(jié)果表明細(xì)胞腹側(cè)表面只有一部分αVβ1和α4β1整合素被激活，并且分布于黏著結(jié)構(gòu)。

圖3 熒光標(biāo)記Fab顯示整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘附結(jié)構(gòu)

關(guān)鍵要點(diǎn)：

l  研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用了各種技術(shù)在單分子水平對(duì)不同整合素亞型激活細(xì)胞鋪展所施加的力進(jìn)行了分析。

l  研究團(tuán)隊(duì)使用Rapid Novor（快序生物）的REmAb蛋白從頭測(cè)序技術(shù)獲得了整合素αV抗體13C2的全長(zhǎng)精準(zhǔn)氨基酸序列，通過(guò)重組表達(dá)合成帶有熒光標(biāo)記的13C2 Fab，用于細(xì)胞表面整合素的成像分析。

參考資料：

[1] Jo MH, Li J, Jaumouillé V, Hao Y, Coppola J, Yan J, Waterman CM, Springer TA, Ha T. Single-molecule characterization of subtype-specific β1 integrin mechanics. Nat Commun. 2022 Dec 3;13(1):7471. doi: 10.1038/s41467-022-35173-w.

[2] https://www.rapidnovor.com/single-molecule-characterization-of-subtype-specific-integrin-mechanics/