引言

納米抗體，是只含有VHH（重鏈抗體可變區(qū)）結(jié)構(gòu)域的單域抗體，來源于駱駝科等動物僅由重鏈組成的重鏈抗體。納米抗體的體積較小，卻保留了與常規(guī)抗體相似的抗原結(jié)合能力。這些特征使其在組織穿透性、穩(wěn)定性和溶解性等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，特別適用于某些治療和診斷領(lǐng)域。因此，了解納米抗體的準(zhǔn)確序列，將有助于理解其構(gòu)效關(guān)系，為診斷工具和治療藥物的研發(fā)提供關(guān)鍵信息，推動納米抗體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

納米抗體的結(jié)構(gòu)

納米抗體僅由一條約含110個氨基酸的多肽鏈構(gòu)成，分子量約為15 kDa（圖1）。它包含了結(jié)合抗原并引發(fā)與傳統(tǒng)抗體相似反應(yīng)所需的所有功能域。納米抗體與常規(guī)抗體的VH（重鏈可變區(qū)）結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)特征方面既有許多相似之處，也存在諸多不同（圖2）。

圖1 常規(guī)IgG抗體、駱駝科動物抗體和納米抗體之間的結(jié)構(gòu)差異 

相似之處：

框架區(qū)：由四個保守的骨架區(qū)（FR）組成。

互補(bǔ)決定區(qū)：具有互補(bǔ)決定區(qū)（CDR1-3），這些區(qū)域高度可變，負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合。

折疊方式：其FR和CDR會折疊成兩個β折疊片層，其中一個由四條β鏈組成，另一個由五條β鏈組成。CDR位于β鏈之間，形成抗原結(jié)合位點。

不同之處：

結(jié)構(gòu)復(fù)雜性：納米抗體是單體形式，僅有三個CDR，而常規(guī)抗體的VH有六個CDR。

抗原結(jié)合能力：納米抗體由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜性降低，使其CDR1環(huán)擴(kuò)大，CDR3環(huán)延伸，這有助于增加納米抗體在抗原結(jié)合方面的多樣性（圖2）。

二硫鍵：常規(guī)抗體的VH含有許多二硫鍵，將其與輕鏈可變區(qū)（VL）相連。納米抗體VHH通常僅含有一個二硫鍵，有助于它的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

氨基酸組成：常規(guī)抗體的VH和VL之間需要相互作用，其FR2含有保守的疏水性氨基酸殘基。對于納米抗體而言，F(xiàn)R2由親水性氨基酸殘基組成。

互補(bǔ)位形狀：由于納米抗體的CDR3環(huán)得以延伸，所以它們呈現(xiàn)出凸形的互補(bǔ)位形狀，而常規(guī)抗體VH - VL的互補(bǔ)位則是凹形或扁平的。

圖2 常規(guī)IgG抗體VH結(jié)構(gòu)域與駱駝科動物抗體VHH結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)構(gòu)差異

基于從頭測序的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)獲得并重組表達(dá)納米抗體

Rapid Novor（快序生物）獨(dú)有的基于質(zhì)譜蛋白從頭測序技術(shù)的抗體發(fā)現(xiàn)路徑，可以對血清抗體直接測序，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液和免疫系統(tǒng)篩選的優(yōu)質(zhì)納米抗體，具體流程如下（圖3）。

1. 免疫：使用目標(biāo)抗原對駱駝或羊駝進(jìn)行免疫，引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生識別抗原的抗體。

2. 提取與篩選：從免疫過的駱駝科動物身上提取血液，并使用抗原親和純化法對血清進(jìn)行純化，獲得針對目標(biāo)抗原的重鏈抗體。

3. 酶解：將分離出的重鏈抗體用多種酶進(jìn)行酶解，使其成為肽段。

4. 測序：利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）和從頭測序技術(shù)對肽段進(jìn)行測序。借助基于機(jī)器學(xué)習(xí)（ML）的生物信息學(xué)方法，將測序獲得的肽段序列拼接成完整的抗體序列。

5. 重組生產(chǎn)：將納米抗體序列插入表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染到選定的宿主細(xì)胞中。經(jīng)過細(xì)胞擴(kuò)增后，便可生產(chǎn)出所需的納米抗體。

6. 純化與質(zhì)量分析：經(jīng)過不同的純化步驟，如親和色譜法，去除雜質(zhì)并分離出所需的納米抗體。隨后通過SDS-PAGE、ELISA、質(zhì)譜測序等方法，對獲得的納米抗體進(jìn)行質(zhì)量分析。

圖3 REpAb抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)用于納米抗體的開發(fā)應(yīng)用

納米抗體的應(yīng)用

納米抗體自被發(fā)現(xiàn)以來，便作為極有價值的工具，在診斷、治療和研究等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。

1. 診斷應(yīng)用

納米抗體由于具有更高的親和力與穩(wěn)定性、更多樣的互補(bǔ)位庫以及不與宿主抗體發(fā)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點，非常適合用于免疫測定。例如，納米抗體已被證明，比常規(guī)抗體更適用于寄生蟲的檢測。納米抗體能比常規(guī)抗體更深入地穿透組織，且腎臟清除速度更快，因此也極適用于開發(fā)正電子發(fā)射型計算機(jī)斷層顯像（PET）等診斷成像方法。近期研究表明，與常規(guī)抗體相比，納米抗體有更優(yōu)的PET成像效果，且對非靶器官的輻射更少，進(jìn)一步凸顯了納米抗體在科研和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的優(yōu)勢。

2. 治療應(yīng)用

納米抗體憑借其高特異性、親和力、溶解性、熱穩(wěn)定性以及組織和細(xì)胞穿透性等特性，成為治療藥物的極佳候選分子。此外，與常規(guī)抗體治療藥物相比，納米抗體還具有低聚集性、低免疫原性和較短的血清半衰期，可以被設(shè)計用來靶向幾乎任何致病的分子靶點。

癌癥治療：納米抗體因為能較輕松地穿透腫瘤，并且可以靶向癌癥特異性靶點，在癌癥治療領(lǐng)域尤其具有優(yōu)勢。例如，在2022年，美國FDA批準(zhǔn)了表達(dá)納米抗體的CAR T療法，用于治療多發(fā)性骨髓瘤。

自身免疫性疾病治療：納米抗體給自身免疫性疾病的治療帶來了重大變革。例如，在2019年，美國FDA批準(zhǔn)了一種納米抗體治療藥物，用于治療一種罕見的凝血障礙疾病。此外，研究表明針對TNF-α受體的納米抗體能夠通過將治療藥物特異性地遞送至炎癥組織，提高類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸?。↖BD）治療的安全性和有效性。

傳染?。貉芯咳藛T發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)抗體療法相比，納米抗體具有更好的病毒中和能力。納米抗體能夠靶向常規(guī)抗體無法觸及的特定隱蔽表位，從而更加有效。例如，針對SARS-CoV-2開發(fā)的納米抗體在靶向特定隱蔽表位方面已展現(xiàn)出良好前景。此外，納米抗體不太容易出現(xiàn)“疫苗逃逸”和“突變逃逸”現(xiàn)象，這使得它們在應(yīng)對新冠疫情時更加高效。盡管要將納米抗體治療藥物推向市場還需要更多的研究，但它們的潛力極為廣闊。

從頭測序技術(shù)推動納米抗體開發(fā)應(yīng)用

納米抗體作為生物技術(shù)領(lǐng)域的革新力量，為醫(yī)學(xué)診斷和治療開辟出全新的可能。然而要充分發(fā)揮其潛力，就必須了解其精準(zhǔn)的氨基酸序列，以此開發(fā)和優(yōu)化納米抗體的應(yīng)用。

Rapid Novor（快序生物）是蛋白從頭測序技術(shù)的領(lǐng)跑者，通過全球頂尖的從頭測序算法，可以無需借助任何數(shù)據(jù)庫，直接對抗體測序，獲得全長精準(zhǔn)氨基酸序列。

Rapid Novor（快序生物）的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)可以直接從免疫動物的血清多抗中鑒定出優(yōu)質(zhì)抗體序列，從而加快納米抗體藥物的開發(fā)進(jìn)程，最終推動它們進(jìn)入市場。如需了解更多抗體測序服務(wù)的信息，請通過公眾號與我們聯(lián)系。

參考資料

https://www.rapidnovor.com/nanobody-sequencing/