CAR-T細(xì)胞療法在白血病中取得了不錯(cuò)的療效，但是進(jìn)一步將CAR-T運(yùn)用于實(shí)體瘤治療時(shí)其效果卻不盡人意。這是因?yàn)镃AR-T靶向的是細(xì)胞表面的抗原，而大多數(shù)致癌因子是來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的致癌因子無(wú)法被CAR-T識(shí)別和攻擊。TCR-T靶向細(xì)胞內(nèi)突變的蛋白能夠顯著的殺傷腫瘤細(xì)胞。如果CAR-T細(xì)胞也能靶向細(xì)胞內(nèi)的致癌蛋白，那么將成為克服實(shí)體瘤的有力工具。

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種幾乎沒(méi)有突變的腫瘤，是由表觀遺傳失調(diào)所導(dǎo)致的。想要靶向這類非突變腫瘤是十分困難的，本文采取的以肽段為中心的CAR-T技術(shù)（PC-CARs）解決了這一難題。

摘要

團(tuán)隊(duì)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的免疫肽組中發(fā)現(xiàn)了腫瘤發(fā)生所必需的肽段QYNPIRTTF，該肽段是由HLA-A*24:02呈遞到細(xì)胞表面的非突變肽，來(lái)源于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PHOX2B。為了靶向QYNPIRTTF，團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了以肽段為中心的嵌合抗原受體（PC-CARs）。同時(shí)該P(yáng)C-CARs還可以識(shí)別由HLA-A*23:01呈遞的QYNPIRTTF。最后，團(tuán)隊(duì)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明了PC-CARs能高效和特異性殺傷神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，小鼠的腫瘤達(dá)到了完全消退的程度。這些數(shù)據(jù)表明，PC-CARs能夠擴(kuò)大免疫治療的靶點(diǎn)范圍，尤其是無(wú)免疫原性的細(xì)胞內(nèi)癌蛋白，并可以靶向多種HLA基因型。

圖1. 腫瘤特異性抗原發(fā)現(xiàn)和CAR-T改造全流程

結(jié)果

1. 腫瘤特異性抗原的鑒定
   

   首先，團(tuán)隊(duì)通過(guò)MHC捕獲、肽段洗脫和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），對(duì)8個(gè)高危的神經(jīng)母細(xì)胞瘤原發(fā)腫瘤進(jìn)行免疫肽組學(xué)檢測(cè)，重點(diǎn)檢測(cè)HLA-A*02:01和HLA-A*24:02結(jié)合的肽段。質(zhì)譜鑒定到9117個(gè)肽段，使用IC50閾值小于500nM篩選出6483個(gè)強(qiáng)結(jié)合肽段。結(jié)合TARGET和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出腫瘤組織和正常組織差異表達(dá)的133個(gè)肽段。去除在正常組織中表達(dá)的肽段，還剩56個(gè)肽段（圖2b）。最后根據(jù)pMHC復(fù)合物結(jié)合親和力、HLA等位基因頻率、親本基因差異表達(dá)程度、MHC與其他肽的相對(duì)豐度、多發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤的復(fù)發(fā)以及與神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)的相關(guān)性對(duì)肽段進(jìn)行了排序。從CHRNA3、GFRA2、HMX1、IGFBPL1、PHOX2B和TH中各選擇一個(gè)肽段進(jìn)行臨床前開(kāi)發(fā)（圖2d）。

圖2.腫瘤特異性抗原的發(fā)現(xiàn)和篩選

通過(guò)檢測(cè)PHOX2B的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，PHOX2B在所有正常組織中均不表達(dá)，只在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)（圖3e）。然后團(tuán)隊(duì)利用時(shí)間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了發(fā)育過(guò)程中PHOX2B的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PHOX2B只在胎兒發(fā)育期間表達(dá)，在出生后就不表達(dá)了（圖3h）。由此表明PHOX2B在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中是一種高度特異性的腫瘤抗原，是腫瘤靶向治療的理想候選物。

圖3. PHOX2B在腫瘤中特異性高表達(dá)

2. 篩選靶向PHOX2B的scFv

由于PHOX2B的非突變肽QYNPIRTTF缺乏免疫原性，經(jīng)過(guò)多次篩選，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高親和力的T細(xì)胞受體（TCRs）。團(tuán)隊(duì)于是放棄TCR-T方法，選擇使用CAR-T的篩選方法，找到靶向pMHC復(fù)合物的抗體單鏈可變區(qū)片段（scFv）。

為了篩選特異性的scFv，團(tuán)隊(duì)采用了保留展示（Retained Display）系統(tǒng)，該系統(tǒng)是一種蛋白質(zhì)展示平臺(tái)，可以在通透的細(xì)菌內(nèi)，使用流式細(xì)胞技術(shù)篩選pMHC結(jié)合的scFv。文庫(kù)的復(fù)雜度>1011，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選到25個(gè)scFv。利用sCRAP預(yù)測(cè)了交叉反應(yīng)性最低、特異性最強(qiáng)的克隆10LH進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，與其他候選的scFv相比，只有兩個(gè)肽段與10LH的相對(duì)結(jié)合度>10%（圖4b）。

圖4.篩選pMHC特異性的scFv

3. PC-CAR T細(xì)胞可以識(shí)別不同HLA基因型上的相同多肽

團(tuán)隊(duì)使用抗原呈遞工具ShinyNAP8來(lái)預(yù)測(cè)能夠呈遞相同QYNPIRTTF肽段的其他HLA基因型。該工具確定了其他8個(gè)常見(jiàn)的HLA。接著使用四聚體染色實(shí)驗(yàn)測(cè)量了10LH識(shí)別這些pMHC復(fù)合物的能力。除了HLA-A*24:02外，10LH還可以結(jié)合HLA-A*23:01呈遞的QYNPIRTTF?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)證明PC-CAR具有擴(kuò)大接受免疫療法患者群體的潛力。

4. PC-CAR T細(xì)胞選擇性地消除腫瘤

團(tuán)隊(duì)使用轉(zhuǎn)導(dǎo)10LH和302LH的CAR-T細(xì)胞治療患有神經(jīng)母細(xì)胞瘤的小鼠。用10LH轉(zhuǎn)導(dǎo)的PC-CAR T細(xì)胞治療小鼠，在HLA-A*24:02（SKNAS和COG-564x）和HLA-A*23:01腫瘤模型（NBSD）中都有顯著的殺傷腫瘤效果（圖5g）。其中COG-564x模型是由一名多次復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)MYCN擴(kuò)增神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者死后抽血生成的。在這個(gè)小鼠模型中，腫瘤的生長(zhǎng)速度非?？?。在本次實(shí)驗(yàn)中，在PC-CAR T細(xì)胞治療后僅1周，腫瘤就有顯著的衰減。

圖5.PC-CAR T細(xì)胞在不同腫瘤模型中的殺傷效果

討論

作者根據(jù)免疫肽組篩選到一個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的特異性靶點(diǎn)-非突變肽QYNPIRTTF，但是非突變肽沒(méi)有免疫原性，不能引發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)，這是因?yàn)門(mén)細(xì)胞一般不會(huì)識(shí)別自身抗原，因此不適用于TCR-T治療（文中沒(méi)有篩選到識(shí)別該非突變肽的高親和力T細(xì)胞受體），這樣導(dǎo)致了有好的靶點(diǎn)，卻沒(méi)有好的工具去靶向它。“山重水復(fù)疑無(wú)路，柳暗花明又一村”，作者并沒(méi)有放棄，而是找到一條新的出路。利用篩選抗體的方法，找到一個(gè)特異性的scfv靶向非突變肽，并通過(guò)基因工程將scfv表達(dá)在CAR-T上，讓CAR-T細(xì)胞能靶向無(wú)免疫原性的肽段，進(jìn)而能殺傷實(shí)體瘤細(xì)胞。由此開(kāi)辟了全新的道路，使得CAR-T能靶向?qū)嶓w瘤的同時(shí)，也能靶向無(wú)免疫原性的靶點(diǎn)。

關(guān)注點(diǎn)

1.  文中使用的免疫肽組檢測(cè)方法是基于蛋白組學(xué)搜庫(kù)的方法，這種方法基本上檢測(cè)不到突變的肽段。如果使用快序生物的從頭測(cè)序技術(shù)，一種不依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)的肽段鑒定方法，能夠發(fā)現(xiàn)更多的突變肽段，提供更廣泛的靶點(diǎn)。我們使用高分辨率、高精度的質(zhì)譜儀結(jié)合快序獨(dú)立研發(fā)的蛋白從頭測(cè)序分析平臺(tái)，可以準(zhǔn)確鑒定到樣品中的突變氨基酸，從而突破了腫瘤樣品突變負(fù)荷的限制。即使在那些突變負(fù)荷很低的腫瘤中，我們的腫瘤新抗原鑒定服務(wù)也能比普通蛋白組學(xué)搜庫(kù)方法鑒定到更多突變肽段。
   
   2. 文中使用的基于文庫(kù)篩選scFv的方法，但是文庫(kù)的容量畢竟是有限的，因此所能得到的scFv的多樣性也大打折扣。而通過(guò)免疫動(dòng)物得到的抗體，親和力和特異性更強(qiáng)?？煨蛏锏目贵w發(fā)現(xiàn)技術(shù)能夠從各種動(dòng)物甚至是人的血液樣品中發(fā)現(xiàn)天然的抗體，幫助您直接而高效地發(fā)現(xiàn)更多功能性天然抗體。

參考文獻(xiàn)：

Yarmarkovich M, Marshall QF, Warrington JM, et al. Targeting of intracellular oncoproteins with peptide-centric CARs. Nature. 2023;623(7988):820-827.