摘要

作者選取25例黑色素瘤患者的腫瘤組織，用IP的方法純化了HLA I類和HLA II類結(jié)合的多肽，檢測(cè)到多達(dá)95,500個(gè)多肽。然后，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與WES測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)，篩選到11個(gè)突變肽，其中4個(gè)具有免疫原性，能刺激T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并在患者的腫瘤和外周血中檢測(cè)到對(duì)這4個(gè)突變肽具有特異反應(yīng)性的T細(xì)胞。由此得出的結(jié)論是，通過(guò)質(zhì)譜法直接從原發(fā)腫瘤組織中鑒定突變新抗原是可行的，并且可以篩選到腫瘤免疫治療密切相關(guān)的新表位。

結(jié)果
1.質(zhì)譜法鑒定HLA結(jié)合的多肽

圖1. HLA呈遞多肽的特征

作者選取25例黑色素瘤患者的腫瘤組織純化了HLA I類和HLA II類結(jié)合的多肽，使用先進(jìn)的質(zhì)譜儀對(duì)IP下來(lái)的多肽進(jìn)行了LC-MS/MS測(cè)量，然后用MaxQuant進(jìn)行搜庫(kù)和生信分析。確定了95,662個(gè)唯一肽段序列（圖1a）。在12663個(gè)蛋白中發(fā)現(xiàn)有78605個(gè)HLA I類肽，在2832個(gè)蛋白中發(fā)現(xiàn)有78605個(gè)HLA II類肽。洗脫的肽顯示出特征長(zhǎng)度分布，HLA I類肽的長(zhǎng)度分布在9-14個(gè)氨基酸，HLA II類肽的長(zhǎng)度分布在12-18個(gè)氨基酸（圖1b）。

2.MS和WES測(cè)序聯(lián)合鑒定突變肽

圖2. 突變肽的篩選流程圖

為了測(cè)試質(zhì)譜的方法能否鑒定突變肽，并驗(yàn)證它們是否能成為新抗原（圖2a），作者首先對(duì)從5例患者腫瘤中提取DNA進(jìn)行了全外顯子測(cè)序（WES）。然后將5名患者的MS原始數(shù)據(jù)與WES數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，直接鑒定出11個(gè)人類原發(fā)癌癥組織中的突變肽。作者合成了所有的突變肽，發(fā)現(xiàn)它們的MS/MS譜圖和洗脫時(shí)間與內(nèi)源的肽段相同。

3.檢測(cè)到的磷酸化肽段

圖3. 肽段磷酸化的位點(diǎn)

即使不用磷酸化抗體富集，作者在HLA抗體IP下來(lái)的肽段中檢測(cè)到365個(gè)磷酸化肽段。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)有78%的磷酸化發(fā)生在絲氨酸上，19%的磷酸化發(fā)生在蘇氨酸上，剩下的3%在酪氨酸上。長(zhǎng)度在9-11個(gè)氨基酸的肽段，其磷酸化修飾主要發(fā)生在第4個(gè)位點(diǎn)；而12個(gè)氨基酸肽段的4號(hào)和6號(hào)位的磷酸化最多 (圖3d)。脯氨酸定向磷酸化也是HLA結(jié)合的磷酸化肽段的一個(gè)特征（圖3e）。以上結(jié)果說(shuō)明質(zhì)譜法能夠直接鑒定磷酸化肽段，暗示了磷酸化肽段也能成為免疫治療的靶點(diǎn)。

4.突變肽的免疫原性驗(yàn)證

圖4. T細(xì)胞對(duì)突變肽的免疫應(yīng)答

為了驗(yàn)證質(zhì)譜檢測(cè)到的突變肽是否可以被患者自身T細(xì)胞識(shí)別。Mel15患者在使用Ipilimumab治療后，經(jīng)靜脈穿刺取出PBMC（圖4a,b）。用突變肽刺激PBMC兩天后，通過(guò)ELISpot觀察到明顯的T細(xì)胞反應(yīng)（圖4c）。其中有四個(gè)突變肽能誘發(fā)T細(xì)胞反應(yīng)：SYTL4S363F、NCAPG2P333L、H3F3CT4L、ABCC2S1342F。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)PBMC進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的刺激會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞擴(kuò)增。這些T細(xì)胞對(duì)SYTL4S363F和NCAPG2P333L具有特異性，但對(duì)正常肽段沒(méi)有特異性。

點(diǎn)評(píng)
作者首次提取出了黑色素瘤組織樣本中HLA I類和II類結(jié)合的多肽，從而鑒定了近10萬(wàn)個(gè)天然存在于腫瘤樣品中的肽段，使得質(zhì)譜成為鑒定腫瘤新抗原的有力工具。即使沒(méi)有進(jìn)一步富集，也可以檢測(cè)到含有磷酸化等翻譯后修飾的肽段，表明質(zhì)譜鑒定有著基因測(cè)序方法所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與WES比對(duì)后發(fā)現(xiàn)了11個(gè)突變肽，其中4個(gè)具有免疫原性。因此采用質(zhì)譜法鑒定腫瘤新抗原是有臨床應(yīng)用潛力的。

關(guān)注點(diǎn)

采用全外顯子測(cè)序（WES）和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），然后通過(guò)計(jì)算機(jī)算法預(yù)測(cè)新抗原是目前常見(jiàn)的腫瘤新抗原鑒定方法，這種方法需要大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證潛在新抗原的免疫原性。而WES和MS聯(lián)用可以大大縮小新抗原肽段的篩選范圍，提高新抗原篩選的準(zhǔn)確性和效率。同時(shí)，采用MS的方法還可以鑒定到基因測(cè)序無(wú)法鑒定到的翻譯后修飾肽段，如上文中提到的磷酸化肽段。

參考文獻(xiàn)：Bassani-Sternberg M , Brunlein E , Klar R ,et al.Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry[J].Nature Communications, 2016, 7:13404.