免疫肽組（immunopeptidomics）是由MHC I類或者MHC II類分子呈遞到細胞表面的所有多肽組成的，這些多肽可以被T細胞識別。免疫肽組將多肽組和免疫聯(lián)系起來，通過鑒定免疫肽組，一方面可以發(fā)現(xiàn)個性化的腫瘤治療靶點，即腫瘤新抗原靶點（MHC分子呈遞到細胞表面的突變肽），來對單個患者進行精準的靶向治療；另一方面也能找到患者間共享的抗原，讓更多的腫瘤患者受益。本文就是通過鑒定群體的免疫肽組找到了一個高表達的共享位點COL6A3-FLNV，針對此位點改造的TCR具有治療腫瘤的療效。

摘要

為了治愈更多的患者，需要找到患者間共享的腫瘤抗原，團隊選用了群體規(guī)模的免疫肽組鑒定，使用質(zhì)譜定量分析了約1500個腫瘤和正常組織樣品。他們發(fā)現(xiàn)了一個HLA-A*02:01呈遞的泛癌抗原——膠原VI型α-3（COL6A3），該抗原在多種實體癌中特異性高表達，在正常組織中幾乎不表達，是一個理想的腫瘤治療靶點。然而，研究發(fā)現(xiàn)，天然的特異性T細胞僅對COL6A3/HLA-A*02:01高表達的腫瘤細胞有反應活性。為了增強T細胞的抗腫瘤反應，讓其對COL6A3低表達的腫瘤細胞也有反應，團隊利用酵母展示技術篩選到兩個特異性TCR的突變體a1b4和awb4，改造后的TCR變體能夠有效殺傷小鼠體內(nèi)的腫瘤，顯示出良好的安全性，無明顯脫靶效應，為TCR靶向多種實體瘤的臨床試驗鋪平了道路。

結(jié)果

1. 群體規(guī)模定量免疫肽組發(fā)現(xiàn)了泛癌抗原COL6A3-FLNV

利用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）對HLA I結(jié)合的多肽進行鑒定和定量。團隊選擇使用HLA-A*02特異性抗體（在美國白人種群中HLA-A*02亞型占比超過40%）進行免疫沉淀（IP）后，鑒定了739個腫瘤組織和673個正常組織的HLA-A*02呈遞的多肽。該方法從腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了一個共享多肽COL6A3-FLNV，位于COL6A3的第6個外顯子上，是由選擇性剪接產(chǎn)生的變異多肽，序列為FLLDGSANV。數(shù)據(jù)顯示，在28% （n = 210）的腫瘤中檢測到COL6A3-FLNV，而正常組織樣品只有1% （n = 7）能檢測到（圖1A）。值得注意的是，兩個最明顯的正常組織來自于胎盤，而癌癥患者一般不會有胎盤組織。統(tǒng)計結(jié)果顯示，腫瘤細胞表面呈遞的COL6A3-FLNV比正常組織要高23倍。

為了更加準確的定量COL6A3-FLNV，團隊使用平行反應監(jiān)測（PRM）技術確定細胞表面COL6A3-FLNV的絕對拷貝數(shù)，合成了穩(wěn)定同位素標記的多肽作為內(nèi)標，通過高靈敏度靶向質(zhì)譜來實現(xiàn)絕對定量。一共檢測了233個腫瘤和正常組織樣品，在134個腫瘤樣品中有55個檢測到了COL6A3-FLNV，平均每個細胞有228個拷貝（CpC），單個腫瘤樣品最高有1928個CpC。在99個正常組織樣品中，只在6個組織中檢測到此多肽，平均含量為28 CpC，最高含量為49 CpC。多肽的絕對定量結(jié)果提示了TCR治療的一個窗口期。

圖1. 質(zhì)譜檢測到腫瘤（紅色）和正常組織（藍色）中的COL6A3-FLNV抗原

圖2.發(fā)現(xiàn)靶向COL6A3-FLNV抗原的特異性TCR

為了驗證COL6A3-FLNV特異性TCR在體內(nèi)是否具有抗腫瘤功能，團隊構(gòu)建了小鼠腫瘤模型。D10 TCR轉(zhuǎn)導的T細胞抗腫瘤效果最好，但是有脫靶風險。H3 TCR轉(zhuǎn)導的T細胞基本沒有抗腫瘤效果。而F9 TCR轉(zhuǎn)導的T細胞確實延緩了腫瘤的進展，但是與D10 TCR相比，表達F9 TCR的T細胞的抗腫瘤效果較弱（圖3C），這表明需要進一步加強F9 TCR的活性。

圖3. COL6A3-FLNV特異性TCR-T體內(nèi)的抗腫瘤能力

3. 酵母表面展示方法篩選出親和力更強的F9 TCR突變體

為了篩選到更高親和力的TCRs，作者使用酵母表面展示的方法篩選F9 TCR的突變體，最終選擇了a1b4和awb4這兩個突變體，它們能夠特異識別COL6A3-FLNV，并且無脫靶效應，具有很好的安全性（圖4A）。

與親本F9 TCR相比，a1b4和awb4突變TCR在COL6A3-FLNV濃度降低10至100倍的情況下依然能激活CD8 T細胞（圖4C），表明TCR親和力的增強使得T細胞能靶向拷貝數(shù)更低的抗原肽。高親和力的TCR甚至能激活CD4 T細胞，COL6A3-FLNV可以在一定程度上以一種共受體不依賴的方式激活a1b4和awb4 TCR轉(zhuǎn)導的CD4 T細胞（圖4B）。

圖4. 評估a1b4和awb4突變體T細胞的激活反應

4. a1b4和awb4 TCR-T細胞在體內(nèi)的抗腫瘤效果

為了驗證高親和力突變體TCR-T細胞具有抗腫瘤的能力，團隊構(gòu)建了小鼠腫瘤模型。將腫瘤細胞植入皮下側(cè)腹，并于第8天靜脈注射表達a1b4和awb4 突變TCR的T細胞。結(jié)果觀察到未突變的F9 TCR轉(zhuǎn)導的T細胞控制腫瘤的能力很小，相比之下，兩種突變體TCRs（a1b4和awb4）都能快速地、持久地殺傷腫瘤細胞（圖5B-E）。而且表達a1b4 TCR的T細胞顯示出比awb4更強大和更持久的抗腫瘤反應?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，表達awb4或a1b4 TCR的T細胞是有可能用于靶向并消除人類腫瘤的。

關注點

本文使用的群體規(guī)模的免疫肽組鑒定，發(fā)現(xiàn)了多個患者以及多種腫瘤中共有的新抗原COL6A3-FLNV，針對該抗原開發(fā)的TCR-T過繼性免疫治療方法，有望實現(xiàn)治療多種腫瘤類型或者延緩腫瘤的復發(fā)。

除此之外，對于免疫肽組鑒定還有一種個體化的治療方案，就是檢測單個患者的腫瘤組織和正常組織中的體細胞突變，找到單個個體所特有的腫瘤新抗原，實現(xiàn)高精度高特異性的精準治療，能大大提升治愈腫瘤的希望。

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2）更真實，直接鑒定與MHC I結(jié)合的肽段，真實展現(xiàn)細胞表面被呈遞的腫瘤抗原；

3）更多樣，獨有的肽段從頭測序技術能夠鑒定到多種不同來源的突變肽段；

4）更靈活，靈活選擇弱酸洗脫或免疫沉淀法提取肽段，最大限度獲取更多肽段。

參考文獻：

Kim GB, Fritsche J, Bunk S, et al. Quantitative immunopeptidomics reveals a tumor stroma-specific target for T cell therapy. Sci Transl Med. 2022;14(660):eabo6135.