Tumor protein P53 (TP53)，也叫p53，是一個(gè)抑癌基因。超過50%的癌癥病人的TP53基因都有突變。但是以這個(gè)基因?yàn)榘悬c(diǎn)的抗腫瘤藥物目前為止還不存在。今天介紹的文章提供了一種全新的思路，以TP53突變產(chǎn)生的新抗原為靶點(diǎn)，研發(fā)了一種雙特異性抗體，該抗體可以提高腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞的結(jié)合效率，進(jìn)而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的效果。
摘要
本文中，研究人員通過質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一個(gè)帶有TP53-R175H突變的新抗原肽段確實(shí)能夠被遞呈到細(xì)胞膜上。TP53-R175H（第175位的R突變?yōu)镠）是癌癥中最常見的突變，含有這個(gè)突變的肽段HMTEVVRHC（突變的H用下劃線標(biāo)記）能夠結(jié)合HLA-A*02:01。而HLA-A*02:01是美國白人中最常見的HLA I亞型。因此HMTEVVRHC與HLA-A*02:01結(jié)合的復(fù)合物被認(rèn)為是極具吸引力的靶點(diǎn)。研究人員通過噬菌體展示技術(shù)得到了一種能夠特異識(shí)別該新抗原與HLA-A*02:01二元復(fù)合物的單鏈抗體。之后通過改造將該抗體與另一個(gè)識(shí)別CD3ε的單鏈抗體相連，最終得到一個(gè)雙特異性抗體。研究人員通過實(shí)驗(yàn)證明了腫瘤細(xì)胞能夠通過該抗體高效地激活T細(xì)胞。研究人員進(jìn)而解析了抗體，新抗原，HLA-A*02:01三元復(fù)合物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。與基于T細(xì)胞的免疫療法相比，該雙特異性抗體具有良好的成藥性，和很高的潛力可以用來治療癌癥。
實(shí)驗(yàn)流程與結(jié)果
1. 質(zhì)譜鑒定
研究人員通過質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)確定了肽段HMTEVVRHC能夠被遞呈到細(xì)胞膜表面，進(jìn)而通過定量質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，探明了這個(gè)肽段在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量很低，每個(gè)細(xì)胞只有1-2個(gè)拷貝。
2. 利用噬菌體展示技術(shù)獲得抗體
研究人員采用了一個(gè)含有大量scFv的噬菌體庫來尋找能夠識(shí)別HMTEVVRHC與HLA-A*02:01復(fù)合物的單鏈抗體，并成功分離了23種不同的scFv。
3. 構(gòu)建雙特異性抗體
這23種scFv與另外一種能夠識(shí)別CD3ε的scFv相連被構(gòu)建成雙鏈抗體。經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，只有H2號(hào)雙鏈抗體能夠高效地識(shí)別HMTEVVRHC與HLA-A*02:01的復(fù)合物。見下圖A。
4. 解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
研究人員將H2號(hào)抗體, HMTEVVRHC和HLA-A*02:01的三元蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析出來，其分辨率高達(dá)3.5 ?。該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)證實(shí)，H2識(shí)別并結(jié)合含有HMTEVVRHC的HLA-A*02:01。見下圖B。
5. 驗(yàn)證H2號(hào)抗體的特異性
研究人員將肽段HMTEVVRHC中的每一個(gè)氨基酸都突變成剩余的19種氨基酸，從而得到171個(gè)虛構(gòu)的肽段。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其中只有一小部分肽段能夠在體外通過H2號(hào)抗體激活T細(xì)胞。按照這些肽段的序列特征，在人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中只找到3個(gè)真實(shí)存在的肽段。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，這3個(gè)肽段都無法被H2號(hào)抗體識(shí)別，所以H2號(hào)抗體具有良好的特異性。見下圖C。
6. 在老鼠體內(nèi)驗(yàn)證H2號(hào)抗體的效果
老鼠被接種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，而后注射H2號(hào)抗體對(duì)其進(jìn)行治療。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，治療效果顯著。見下圖D。
更“快”的腫瘤新抗原質(zhì)譜鑒定技術(shù), 加快雙特異性抗體的研發(fā)
這篇文章有幾個(gè)細(xì)節(jié)值得我們關(guān)注：
1. NetMHCpan的預(yù)測(cè)結(jié)果并不準(zhǔn)確
經(jīng)NetMHCpan 4.0預(yù)測(cè)，HMTEVVRHC與HLA-A*02:01結(jié)合的可能性很低（binding affinity: 5177.6nM, rank: 9.7%）。但是本文通過質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)成功鑒定到了肽段HMTEVVRHC，再結(jié)合文中的其他數(shù)據(jù)可以斷定HMTEVVRHC確實(shí)能夠與HLA-A*02:01結(jié)合，這明顯與NetMHCpan 4.0的預(yù)測(cè)結(jié)果不一致。因此，僅靠NetMHCpan 4.0等軟件并不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出所有的新抗原，最終還是要依賴于質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來進(jìn)行綜合判定。
2. 新抗原在細(xì)胞表面呈遞量較低
經(jīng)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定，新抗原HMTEVVRHC在KMS26, KLE和TYK-nu細(xì)胞表面的呈遞量非常低，僅為1-2個(gè)拷貝。想要鑒定這類低豐度的新抗原，就必須采用高精度，高靈敏度的質(zhì)譜儀；同時(shí)整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程也要經(jīng)過精心優(yōu)化才能避免真正的新抗原在操作過程中被丟掉。
3. 質(zhì)譜鑒定的新抗原提供了更多的靶點(diǎn)
TP53是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核中。在不裂解細(xì)胞的情況下，無論抗體還是CAR-T對(duì)這個(gè)蛋白都鞭長莫及。但蛋白質(zhì)總要經(jīng)過蛋白酶體降解，而降解之后的肽段會(huì)由HLA I呈遞到細(xì)胞膜表面。因此，通過質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞膜表面HLA I呈遞的肽段進(jìn)行鑒定就能夠?qū)⒛切┰葻o法企及的蛋白轉(zhuǎn)換成免疫療法可以攻擊的潛在靶點(diǎn)，為癌癥的免疫治療提供更多的可能性。
4. 噬菌體展示技術(shù)并非最優(yōu)的選擇
文中通過噬菌體展示技術(shù)來篩選單鏈抗體，成功分離得到H2號(hào)抗體。但噬菌體展示文庫的容量畢竟是有限的，因此所能得到的抗體的多樣性也大打折扣。所以如果能夠通過傳統(tǒng)的免疫動(dòng)物的方法來制作抗體將會(huì)給研究者提供更多，更優(yōu)質(zhì)的候選抗體。但這種方式需要對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)序之后才能將其改造成雙特異性抗體。
上?？煨蛏锟萍加邢薰灸壳巴瞥隽艘惶?/span>更“快”的腫瘤新抗原質(zhì)譜鑒定技術(shù)服務(wù)。這項(xiàng)服務(wù)采用質(zhì)譜儀對(duì)新抗原進(jìn)行鑒定，并不依賴于NetMHCpan 4.0的預(yù)測(cè)結(jié)果。同時(shí)采用高精度，高靈敏度的質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)流程中的細(xì)節(jié)進(jìn)行了深度優(yōu)化，以減少樣品的損失。這項(xiàng)服務(wù)能夠幫助客戶更“快”地鑒定腫瘤新抗原，將那些只表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)部的蛋白轉(zhuǎn)化為免疫療法的靶點(diǎn)，同時(shí)還能加快雙特異性抗體的研發(fā)進(jìn)程。
這項(xiàng)鑒定服務(wù)的技術(shù)流程如下圖所示：
這項(xiàng)鑒定服務(wù)的優(yōu)勢(shì)如下：
1）更直接，不依賴于基因組測(cè)序結(jié)果，而是利用質(zhì)譜鑒定技術(shù)對(duì)肽段進(jìn)行測(cè)序；
2）更真實(shí)，不依賴于NetMHC等預(yù)測(cè)軟件，而是直接從細(xì)胞中提取與MHC I結(jié)合的肽段，這樣測(cè)得的數(shù)據(jù)更接近于細(xì)胞中真實(shí)的生理狀態(tài)；
3）更多樣，獨(dú)有的肽段從頭測(cè)序技術(shù)能夠鑒定到多種不同來源的突變肽段；
4）更靈活，提供弱酸洗脫（MAE）和免疫沉淀（IP）兩種肽段提取方案供客戶選擇。客戶可以根據(jù)樣品類型選擇最優(yōu)的肽段提取方式，以提高樣品的利用率。
同時(shí)，快序生物還提供抗體發(fā)現(xiàn)服務(wù)。該服務(wù)可直接從血液或多克隆抗體中對(duì)抗體蛋白進(jìn)行測(cè)序，獲得單克隆抗體的氨基酸序列，直接高效地發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用且具高親和力的天然抗體，便于生產(chǎn)重組抗體，為抗體研發(fā)提供全新途徑。
參考文獻(xiàn)：Hsiue H C , Wright K M , Douglass J , et al. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation[J]. Science (New York, N.Y.), 371(6533):eabc8697.
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